跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年7月30日；285(31):24099-107.
doi:10.1074/jbc。M110.128470。 Epub 2010年5月19日。

脑海绵状畸形蛋白CCM3的晶体结构对血管完整性至关重要

李晓峰 1, 张荣（音）, 张海峰, 云和, 魏东吉, 王敏, 提图斯·J·博根
附属公司

脑海绵状畸形蛋白CCM3的晶体结构对血管完整性至关重要

李晓峰等。 生物化学杂志. .

摘要

CCM3突变与脑海绵体畸形（CCM）有关，该疾病影响0.1-0.5%的人口。CCM3（PDCD10，TFAR15）被认为与CCM1和CCM2形成CCM复合体；然而，这些相互作用的分子基础尚不清楚。我们已经确定了CCM3的2.5A晶体结构。该结构显示了一个全α-螺旋蛋白，包含两个结构域，一个N端二聚结构域和一个C端黏附靶向（FAT）同源结构域。我们证明CCM3通过这个FAT-homology域与CCM2结合，并且高度保守的FAK-like疏水囊（HP1）的突变消除了CCM3-CCM2的相互作用。该CCM3 FAT-homology域也使用相同的表面与paxillin LD基序相互作用，HP1突变导致CCM3与paxilin在细胞中的部分共定位丢失。疾病相关的CCM3截断影响FAT-homology域，表明FAT-homo域在CCM病因学中的作用。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
CCM3的总体结构。 A类,方案表示CCM3二聚体。CCM3二聚化(二元化)领域和FAT-homology(FAT同源性)域被指示。显示了域之间铰链的位置。B类，方向与相同面板A将一条链显示为灰色表面以及指示的αB到αI的螺旋线。C类，五条已解决的CCM3链围绕残基Lys-69–Lys-70铰链。链的C和DP（P）212121晶体形态显示出最大的铰链角差异，如图所示。两种晶体形式的所有五条链的主干轨迹叠加在N端二聚结构域上。αA，灰色；二聚结构域，绿色；αE和回路EF，橙色；FAT生态学领域，红色.D人类CCM3的序列和二级结构分配。二级结构赋值的人类序列（Swiss-Prot Q9BUL8）和残数用于螺旋αA到αI，并按域着色，如面板B.参与二聚反应的残留物被着色黄色的和疏水袋1（HP1）蓝色34个CCM3序列从人类到果蝇属如图所示。（*）表示相同；（：），高度保守；（.），半保守（参见补充图S4B类用于完全对齐）。本研究中突变的残留物是有色的红色所有结构图均采用Pymol制作。
图2。
图2。
CCM3二聚化。 A类,方案表示CCM3二聚体。分解图显示了螺旋αC的反平行疏水条纹和Ile-66和Leu-67形成的对称疏水焦点。B类，相互作用残基。表面已着色粉红色用于调节N末端二聚化界面的残基。C类，序列守恒。序列守恒着色表面基于34个CCM3序列。较深的蓝色表示保存更高。使用Consurf生成（36）。D类，静电势表示（+60 kT，蓝色; −60千吨，红色).E类，免疫沉淀。CCM3-HA与Flag-CCM3变体共同转染到293T细胞中。CCM3-HA与全长CCM3、CCM3 N末端区域（1–117）和CCM3 FAT结构域（92–212）的关联通过IP和抗标记（M2）检测，然后通过Western blot和抗HA检测。免疫沉淀物中的标志-CCM3用免疫印迹法测定。还测定了输入中的CCM3-HA。箭头指示CCM3。标记1-117用（*）表示，并显示在过度曝光的面板中。风险资本，矢量控制。F类，尺寸排除色谱法。使用Superdex 200分析级SEC柱分析CCM3结构体1–212和92–212。全长（1–212）CCM3作为二聚体洗脱（预测质量：～25 kDa），并构建92–212作为单体洗脱物（预测质量为～14 kDa。用于校准柱的标准品是牛γ-球蛋白158kDa、鸡卵清蛋白44kDa和马肌红蛋白17kDa。K（K）av（平均值）= (V（V）e（电子）−V（V）o（o）)/(V（V）t吨−V（V）o（o）)其中V（V）e（电子）是蛋白质的洗脱体积，V（V）o（o）是空隙体积，以及V（V）t吨是总珠子体积。
图3。
图3。
CCM3 FAT-homology域绑定CCM2。 A类、CCM3、Pyk2和FAK的叠加。Pyk2 FAT域的四个螺旋蓝色（PDB ID:3GM1）（22）和FAK FAT域橙色（PDB ID:1OW7）（23）与CCM3的FAT-homology域重叠(灰色).B类，表面保护。CCM3 FAT-homology域在螺旋αG和αH的表面上表现出非常高的保守性（参见补充图S3). 爆炸图标记了本研究中一些高度保守的残基和突变的残基。C类，下拉。顶部：全长CCM2和预测的CCM2-PTB域下拉全长CCM3的GST融合。CCM3、K132D、K139D、K172D和K179D（CCM3–4KD）中保守赖氨酸的四倍突变使CCM3无法与CCM2一起下拉。底部：CCM3 HP1突变A135D和S175D通过CCM2-PTB结构域抑制CCM3的下拉。全长CCM3和CCM3–92-212下拉式，带有CCM2-PTB。CCM3构建物通过大小排阻色谱纯化并作为单分散峰洗脱。D类，免疫荧光。CCM3 FAT-homology结构域（lhs）或CCM3 FAT-homology-4KD（rhs）与CCM2共转染BAEC，并用间接免疫荧光检测。CCM2和CCM3 FAT-homology部分共同本地化(白色箭头)但HP1突变的引入减少了这种共定位。CCM3构造包括C端子Flag标记和CCM2，即N端子GFP标记。
图4。
图4。
CCM3结合paxillin的LD-motif区域。 A类,左边，CCM3、Pyk2和FAK的叠加，如图3所示A.对，Pyk2彩色蓝色（PDB ID:3GM1）（22），传真输入橙色（PDB ID:1OW7）（23）和CCM3(灰色). 对残留物进行标记以进行比较。B类，与帕罗西汀LD4肽结合的FAK-FAT结构域（PDB ID:1OW7）（23）与CCM3 FAT同源结构域的叠加表明CCM3可以结合LD基序。C类CCM3与CCM2或帕西林联合免疫沉淀。全长CCM3-HA和全长Flag-CCM2、全长Flag-paxilin或矢量控制(风险资本)共转染293T细胞。CCM3免疫沉淀Flag-CCM2和Flag-paxilin。D类，N端子6×His-tagged paxillin-（1–321）下拉CCM3，但不是CCM3–4KD。E–G公司，CCM3下拉菜单和paxillin。E类，帕西林LD-motifs（24，25）下拉全长CCM3的GST融合。信用证GST-LD基序的考马斯染色负载控制。F类CCM3、K132D、K139D、K172D和K179D（CCM3–4KD）中保守赖氨酸的四重突变使CCM3无法使用帕西林LD-motifs下拉。G公司，paxillin LD1，LL7，8RR突变，阻止CCM3下拉。H（H），竞争。CCM2和paxillin竞争结合CCM3。与谷胱甘肽Sepharose珠结合的恒定GST-LD1与恒定CCM3和增加的CCM2 PTB结构域一起孵育。CCM2 PTB结构域与GST-LD1竞争结合CCM3。我和J型，免疫荧光。全长CCM3(我)或CCM3–4KD(J型)转染BAEC。通过间接免疫荧光显微镜检测转染CCM3和内源性paxillin的抗Flag（兔；针对CCM3）和抗paxilin（小鼠），然后检测FITC-结合的抗兔和TRITC-结合的抗小鼠二级抗体。CCM3与内源性帕西林部分共存于迁移细胞的前沿。过度表达的CCM3–4KD在前缘的定位减少（用白色箭头).
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Revencu N.、Vikkula M.（2006）《医学遗传学杂志》。43, 716–721-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Labauge P.、Denier C.、Bergametti F.、Tournier-Lasserve E.（2007）《柳叶刀神经学》。6, 237–244-公共医学
    1. Sahoo T.、Johnson E.W.、Thomas J.W.、Kuehl P.M.、Jones T.L.、Dokken C.G.、Touchman J.W、Gallione C.J.、Lee-Lin S.Q.、Kosofsky B.、Kurth J.H.、Louis D.N.、Mettler G.、Morrison L.、Gil-Nagel A.、Rich S.、Zabramski J.M.，Boguski M.S.、Green E.D.、Marchuk D.A.（1999）《人类遗传学》。8, 2325–2333-公共医学
    1. Günel M.，Awad I.A.，Anson J.，Lifton R.P.（1995）Proc。国家。阿卡德。科学。美国92、6620–6624-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Liquori C.L.、Berg M.J.、Siegel A.M.、Huang E.、Zawistowski J.S.、Stoffer T.、Verlaan D.、Balogun F.、Hughes L.、Leedom T.P.、Plummer N.W.、Cannella M.、Maglione V.、Squiteri F.、Johnson E.W.、Rouleau G.A.、Ptacek L.、Marchuk D.A.（2003）《美国遗传学杂志》。73, 1459–1464-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型