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.2010年6月18日；285(25):18984-90.
doi:10.1074/jbc。M109.099846。 Epub 2010年4月22日。

人类Rad51新功能的发现：线粒体基因组的维持

杰伊·M·塞奇 1, 奥托·S·吉尔德梅斯特, 肯德尔·L·奈特
附属公司

人类Rad51新功能的发现：线粒体基因组的维持

杰伊·M·塞奇等。 生物化学杂志. .

摘要

同源重组（HR）在聚合酶复合物遇到阻断的DNA损伤时，在促进复制叉进展方面起着关键作用，并且它也是DNA双链断裂无错误修复的主要机制。Rad51是所有真核生物中HR的核心催化剂，到目前为止，对人类Rad51的研究仅集中于核内发生的事件。然而，细胞质中存在大量的HR蛋白，但这些蛋白库的功能尚未得到解决。在这里，我们首次证明了Rad51和相关的HR蛋白Rad51C和Xrcc3存在于人类线粒体中。我们显示了应激诱导的每种蛋白的线粒体水平的增加，重要的是，Rad51和线粒体DNA（mtDNA）之间的物理相互作用。Rad51、Rad51C或Xrcc3的缺失导致mtDNA拷贝数的显著降低以及特征性氧化应激诱导的拷贝数增加的完全抑制。我们的结果确定人类线粒体DNA是一种新的Rad51底物，并揭示了HR蛋白在维持人类线粒体基因组中的重要作用。

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数字

图1。
图1。
DNA损伤导致线粒体Rad51、Rad51C和Xrcc3增加。 A类在IR或GO处理后，对细胞进行温和的裂解程序，然后进行一系列高盐洗涤和离心步骤（有关完整描述，请参阅“实验程序”）。B类Western blot分析显示线粒体与细胞溶质和核污染物分离。标记物为ATP合酶和TFAM（线粒体(水户))，GAPDH（细胞溶质(细胞))、层粘连蛋白A/C和PCNA（核(Nuc（数字）))。C类在有或无洋地黄素或SDS的情况下，用蛋白酶K处理分离的线粒体，并使用针对OPA1、内膜空间标记物、TFAM、内基质标记物和Rad51的抗体进行印迹。D类用2 Gy IR处理HCT116细胞，培养30 min或2 h，并按A类对Rad51、Rad51C和Xrcc3以及负载控制ATP合成酶进行等量的线粒体总蛋白免疫印迹。E类用15毫单位/ml GO处理HCT116细胞，并在15分钟和30分钟分馏。对Rad51、Rad51C和Xrcc3以及负载控制ATP合成酶进行等量的线粒体总蛋白免疫印迹。所有印迹至少代表三个独立实验。
图2。
图2。
Rad51以氧化应激依赖的方式与mtDNA进行物理相互作用。 A类在用15毫单位/ml GO处理后的0、15和30分钟，U20S细胞与甲醛孵育，并使用抗Rad51或抗PCNA抗体免疫沉淀mtDNA。结果DNA样本通过SYBR-Green qPCR进行评估，计算mtDNA在模拟IP上的折叠富集变化，并将其归一化为输入DNA(n个= 12). 使用HeLa和HCT116细胞获得了类似的结果（未显示）。B类，实验与A类但使用抗TFAM和抗PCNA抗体进行免疫沉淀。
图3。
图3。
Rad51细胞耗竭导致细胞周期阻滞，并导致线粒体DNA拷贝数的特征性阻滞。 A类，U20S细胞转染非沉默或Rad51特异性siRNA（10 n米最终浓度）。在第2天和第5天分离细胞总DNA，并使用SYBR Green qPCR相对于18S rRNA基因内部对照评估mtDNA拷贝数。量化包括三个独立的实验(误差条表示S.E.）。B类，在处理总DNA之前收获的对照或Rad51 siRNA处理的细胞的代表性细胞计数。误差线表示五个独立实验的S.E。
图4。
图4。
耗尽Rad51、Rad51C或Xrcc3细胞会导致应激诱导的mtDNA拷贝数减少。 A类和B类，U20S细胞转染非沉默、CDK9特异性siRNA或Rad51特异性siRNAs（10 n米最终浓度）。转染后48 h，用5毫单位/ml GO处理细胞，在0、0.5、1和4 h分离DNA，或用2.5毫单位/ml GO处理并在6和8 h分离细胞。用qPCR测定mtDNA拷贝数，计算出相对于非应激对照的变化，并将其归一化为18S rRNA基因的变化。误差线表示S.E.（非沉默n个=6，CDK9n个=4，半径51n个= 4).C类和D类，如上所述用靶向Rad51C或Xrcc3转录物的siRNA转染U20S细胞，并用qPCR（Rad51C）测定mtDNA拷贝数n个=3，Xrcc3n个= 3).
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