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.2010年5月19日;102(10):706-21.
doi:10.1093/jnci/djq102。 Epub 2010年4月13日。

乳腺癌中MicroRNA簇221-222与雌激素受体α相互作用

附属公司

乳腺癌中MicroRNA簇221-222与雌激素受体α相互作用

詹皮罗·迪莱瓦等。 美国国家癌症研究所. .

摘要

背景:一些证据表明,雌激素受体α(ERalpha)阴性乳腺肿瘤是由ERalpha-阳性前体通过不同的分子途径引起的,这种肿瘤具有高度侵袭性,对激素治疗无反应。因为microRNAs(miRNAs)调节基因表达,我们假设它们可能在ER阴性肿瘤的形成中起作用。

方法:基因表达谱用于强调ERalpha蛋白的miRNA调节引起的全球变化。miRNA转染和荧光素酶分析使我们能够识别miRNA206(miR-206)和miRNA2222簇(miR-221-222)的新靶点。通过Northern blot、荧光素酶分析、雌二醇处理和染色质免疫沉淀鉴定miR-221-222转录单位及其调控机制。

结果:ER-阳性细胞中miR-221-222和miR-206的过度表达导致了基因表达的不同整体变化。miR-221和-222增加ERalpha阳性细胞的增殖,而miR-206具有抑制作用(平均吸光度单位[AU]:miR-206:500 AU,95%置信区间[CI])=480至520;miR-221:850 AU,95%置信区间=810至873;miR-222:879 AU,95%置信区间=850-893;P<0.05)。我们分别将肝细胞生长因子受体和叉头盒O3作为miR-206和miR-221-222的新靶点。我们证明,ERalpha通过招募转录共抑制因子伙伴(核受体共抑制因子和视黄酸沉默介质以及甲状腺激素受体)来负性调节miR-221和-222。

结论:这些发现表明,涉及miR-221-222和ERalpha的负调控环可能赋予乳腺癌细胞增殖优势和迁移活性,并促进ER-阳性肿瘤向ER-阴性肿瘤的转变。

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数字

图1
图1
miR-221、-222和-206对基因表达的影响。用干扰序列mRNA对照和miR-206、-221和-222(100 nM)转染MCF7细胞,转染72小时后收集。一个)通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析检测miR-206、221和222水平。实验重复两次,每个重复三次。手段(酒吧)和95%置信区间(误差线)如图所示。B类)western blot分析雌激素受体α(ERα)表达水平,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)水平作为负荷对照。使用以下抗体:小鼠单克隆抗ERα(Santa Cruz,Inc,sc-8002;稀释度1:1000)和小鼠单克隆抗体GAPDH(Calbiochem[Gibbstown,NJ],CB1001;稀释度1-10000)。C类)用qRT-PCR分析ERαmRNA表达水平。GAPDH水平被用作正常化指标。实验进行了两次,结果相似。D类)细胞生长通过基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物的比色细胞增殖试验进行测量。实验重复了四次,每个重复八次,数据用95%置信区间的平均吸光度单位表示(误差线).E)miR-转染的MCF7细胞也接受荧光激活细胞分选分析,并计算相对G1、S和G2/M分区。每个隔室中细胞的百分比是三个独立实验的平均值,实验一式三份。F)干扰序列mRNA控制、miR-206、-221和-222之间差异表达基因的无监督聚类;代表性miR-激活基因(红色)和miR-抑制基因(绿色)在每个分子途径下列出。miR激活的影响因子强度(红色条)被压抑(绿色条)基因显示。Scr=干扰序列microRNA控制。
图2
图2
miR-206、-221和-222对肿瘤抑制和转移基因表达的影响。一个)定量实时聚合酶链式反应,以确认在微阵列分析中统计学上显著调节的多个基因的表达水平:孕酮受体(PGR)、小窝蛋白(CAV)1、CAV2、DNA聚合酶α1(POLA1)、结节性硬化症1(TSC1)、磷酸酶和紧张素同源物(PTEN),骨形态发生蛋白4(BMP)4、BMP7、叉头盒O3(FOXO3)、肝细胞生长因子受体(MET)、细胞周期素依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B)和BCL2-like 11凋亡促进剂(BIM)。将结果归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA水平。实验重复两次,一式三次,结果相似。手段(酒吧)和95%置信区间(误差线)如图所示。B类)miR-206、-221和-222过表达后MCF7细胞中MET、FOXO3、CDKN1B和BIM表达的蛋白质印迹分析。GAPDH被用作负荷控制。使用了以下抗体:兔多克隆抗MET(Santa Cruz,Inc.,sc-10;稀释1:500)、兔多克隆抗体FOXO3,和小鼠单克隆抗GAPDH(Calbiochem CB1001;稀释度1:10000)。C类)CDKN1B启动子和报告的FOXO3结合位点的示意图。D类)miR-221、-222和-206过表达后对两个雌激素受体阳性细胞系MCF7和T47D中CDKN1B启动子的荧光素酶分析;荧光素酶实验一式四份,荧光酶活性读取一式三份。数据以相对萤光素酶活性的方式呈现(酒吧)和95%置信区间(误差线). Scr=干扰序列microRNA控制;TSS=转录起始位点。
图3
图3
识别新的miR-221、-222和-206靶点。一个)预测的miR-221、-222和-206靶点(来自TargetScan)与2390、1014和936基因的交叉分别被miR-206、-221和-222显著抑制,具有统计学意义。B类)miR-221、-222和-206抑制目标的交叉点。C类)示意图描述了TargetScan数据库预测的肝细胞生长因子受体(MET)3′非翻译区(3′UTR)中miR-206的两个潜在结合位点;“保存较差”(绿色)和“保守”(橙色)根据翻译终止密码子,种子区分别定位在499–505和811–817个核苷酸。D类)转染Meg01细胞后测定MET野生型(wt)和MET突变型(mut)质粒的荧光素酶活性;所有荧光素酶实验均以一式四份进行,并以一式三份的形式读取荧光素酶活性。数据以平均值表示(酒吧)相对荧光素酶活性和95%置信区间(误差线).E类)示意图描述了TargetScan数据库预测的miR-221和-222在叉头盒O3(FOXO3)3′UTR中的潜在结合。F类)对FOXO3进行荧光素酶分析,并如前所述(D类). Scr=干扰序列microRNA控制。
图4
图4
雌激素受体α(ERα)对miR-221和-222表达的负调控。一个)用浓度为10μM的5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5′aza)处理MDA-MB-231细胞10天。对5′AZA处理的细胞进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析,检测ERα转录物,数据表达与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA表达相关(顶部). 通过northern blot分析检测miR-221和-222的表达水平。溴化乙锭(EtBr)染色显示为负荷控制(底部). 实验重复了两次,结果相似。B类)MDA-MB-231细胞在激素分泌培养基中培养5天,并转染pCruz-HA-ERα构建物和空白对照。转染后24小时,通过添加浓度为10 nM的雌二醇(E2)刺激细胞,并在培养基中再保存48小时。对转染的细胞进行蛋白质印迹分析,以检测HA-ERα(顶部)和qRT-PCR分析(底部)用于定量检测成熟miR-221和222。(C和D)用小干扰RNA(siRNA)转染ERα阳性MCF7细胞,或用对照siRNA靶向绿色荧光蛋白转染。转染后24小时、48小时、72小时和96小时,对转染细胞进行western blotting分析(C类)用于检测ERα和细胞周期素依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B)蛋白。GAPDH被用作实验的加载控制。qRT-PCR分析(D类)也用于成熟miR-221-222的定量检测。E类)MCF7细胞被激素饥饿5天,然后通过添加浓度为10 nM的E2刺激。对来自E2处理细胞的总RNA进行qRT-PCR,以检测成熟miR-221-222。(F、 G、H)用western blotting分析MCF7-mock和MCF7-HER2细胞系,检测HER2和ERα(F类);将MCF7-mock和MCF7-HER2细胞系饥饿48小时,然后用10 ng/mL浓度的红细胞生成素β1激活。收集细胞并分析ERα(G公司)miR-221和222表达水平(H(H)). 除注明外,所有数据均表示为三个实验的平均值(酒吧)和95%置信区间(误差线). 在western blot分析中,使用了以下抗体:小鼠单克隆抗HA-HRP结合物(Roche Molecular Biochemicals;稀释度1:500)、小鼠单克隆抗体ERα(Santa Cruz,Inc,sc-8002;稀释度1:1000)、兔多克隆抗CDKN1B(Santa Cruz,Inc.,sc-528;稀释度1-500)、,兔抗v-erb-b2多克隆红细胞白血病病毒癌基因同源物2(ERBB2)(Santa Cruz,Inc,sc-134481;稀释度1:500),小鼠单克隆抗GAPDH(Calbiochem CB1001;稀释度1:10000)。NT=未处理;Scr=干扰序列microRNA控制。
图5
图5
miR-221-222转录单位的鉴定。一个)使用启动子2.0和人类polyA信号数据库分析跨越miR-221和-222的11千碱基基因组区域,以搜索启动子和polyA信息序列。示意图表示两个标准TATA盒(蓝色三角形)位于miR-222前体的上游550和190碱基对(bp)(红色圆圈)和三个polyA信号(绿色箭头)位于pre-miR-221(绿色圆圈)的下游。(B类C类)用抗DROSHA的小干扰RNA(siRNA)转染过表达miR-221和-222的MDA-MB-231细胞,或对照siRNA转染绿色荧光蛋白(100 nM)。B类)转染72小时后,对siRNA处理的细胞进行western blot分析以检测DROSHA蛋白,并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)水平作为负荷对照。使用以下抗体:兔多克隆抗Drosha抗体(Santa Cruz,Inc,sc-33778;稀释度1:500)、鼠单克隆抗GAPDH抗体(Calbiochem CB1001;稀释度1:10000)。C类)转染72小时后,siRNA处理的细胞也接受northern blot分析,以检测miR-221(左侧面板)和222(右侧面板)主要转录物。RNA标记(Invitrogen)的位置显示在面板之间。28S核糖体RNA的溴化乙锭染色显示为负载控制。实验重复了两次,结果相似。D类)进行荧光素酶分析以确定miR-221-222发起人。位于前miR-222上游并克隆到pGL3碱性载体中的基因组片段如左图所示。转染后24小时,对转染了相应报告构建物的Meg01细胞进行荧光素酶活性测定。所有荧光素酶实验重复进行四次,数据以95%的置信区间表示。ChrX=X染色体;pri-miR=microRNA的主要转录本。
图6
图6
雌激素受体α(ERα)与miR-221-222以及辅升压蛋白核受体辅升压因子(NCoR)和视黄酸和甲状腺激素受体(SMRT)沉默介质的招募。一个)带有转录起始位点的miR-221-222转录单元示意图(红色圆圈:miR-222,绿色圆圈:miR-221)、polyA信号和规范ERα结合位点(黄色三角形). 染色质免疫沉淀(ChIP)-分析区域用三对黑色箭头.B类)从MDA-MB-231(ER-阴性)和MCF7(ER-阳性)细胞制备交联染色质,并进行ChIP分析。聚合酶链反应(PCR)产物在2%琼脂糖凝胶上进行分析。输入表示ChIP输入的5%。所有实验均一式三份,结果相似。C类)MCF7细胞被激素饥饿5天,然后通过添加浓度为10 nM的雌二醇(E2)刺激。刺激24小时后,将细胞交联并进行ChIP测定。D类)通过实时定量PCR(qRT-PCR)对富含ChIP的DNA进行定量,结果显示为相对富集。这些数据是通过三个实验得出的。E类)用抗ERα或对照siRNA的小干扰RNA(siRNA)转染MCF7。转染72小时后,siRNA处理的细胞交联并进行ChIP分析。F类)用qRT-PCR对ChIP富集的DNA进行定量,结果显示为相对富集。数据代表三个实验的平均值。G公司)将MCF7和MDA-MB-231细胞培养至70%融合,并进行ChIP分析,以分析组蛋白H3和H4乙酰化状态。实验重复进行,结果相同。H(H))对雌二醇刺激的MCF7细胞进行ChIP分析,以检查miR-221-222启动子的乙酰化状态。实验重复进行,结果相同。)将-200/ERE-pGL3b和-200 pGL3b构建物转染MCF7和MDA-MD-231细胞;转染24小时后,进行荧光素酶检测,结果显示为相对荧光素酶活性。J型)ERα敲除后ER-阳性细胞MCF7中-200/ERE的荧光素酶活性。K(K))ERα恢复后,ER阴性细胞MDA-MB-231中-200/ERE的荧光素酶活性。所有荧光素酶实验一式三份进行,并读取荧光素酶活性一式三份。误差线=95%置信区间。AcH3=乙酰组蛋白H3;AcH4=乙酰组蛋白H4;ERE=雌激素反应元件;IgG=免疫球蛋白对照;nt=核苷酸。
图7
图7
miR-206、-221和-222对乳腺癌细胞致癌活性的影响。miR-221-222和miR-206对雌激素受体(ER)阳性细胞的差异作用示意图。这个红十字会表明叉头盒O3(FOXO3)对细胞周期素依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B)和BIM(bcl2相互作用的细胞死亡介质)具有双重抑制作用。橙色线条表示转录调控;蓝色线条表示转录后调控。DDIT4=DNA损伤-诱导转录物4。

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