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.2010年5月；30(10):2460-72.
doi:10.1128/MCB.01583-09。 Epub 2010年3月15日。

RecQL5通过两种平行机制促进基因组稳定——与RNA聚合酶II相互作用和作为解旋酶

努鲁尔·伊斯兰 1, 大卫·福克斯第三, 郭荣（音）, Takemi Enomoto先生, 王伟东
附属公司

RecQL5通过两种平行机制促进基因组稳定——与RNA聚合酶II相互作用和作为解旋酶

努鲁尔·伊斯兰等。 分子细胞生物学. 2010年5月.

摘要

RecQL5解旋酶对于维持基因组稳定性和降低癌症风险至关重要。为了阐明其作用机制，我们纯化了一种RecQL5相关复合物，并鉴定其主要成分为RNA聚合酶II（Pol II）。生物信息学和结构模型引导的突变揭示了RecQL5中的两个保守区域，即KIX和SRI结构域，这两个结构域在Pol II的转录调控因子中已为人所知。RecQL5-KIX结构域结合聚合酶的起始（Pol IIa）和延伸（Pol II o）形式，而RecQL5-SRI结构域仅与延伸形式相互作用。全功能RecQL5需要解旋酶活性和与起始聚合酶结合，因为缺乏这两种活性的突变体在抑制姐妹染色单体交换和抵抗喜树碱诱导的DNA损伤方面都有部分缺陷，而缺乏这两个活性的突触则完全有缺陷。我们认为RecQL5通过两种平行机制促进基因组稳定：作为RecQ解旋酶参与同源重组依赖性DNA修复，以及通过调节Pol II的启动来减少转录相关的复制损伤和重组。

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数字

图1。
图1。
RecQL5复合体的主要组成部分是Pol II。（a） 用Flag IP从表达Flag-RecQL5（FRecQL5）的HeLa细胞分离的RecQL5-Pol II复合物的银染SDS-PAGE凝胶。指出了质谱分析鉴定的三种主要多肽。还表明存在免疫球蛋白（免疫球蛋白G[IgG]重链[H]和IgG轻链[L]）。包括缺乏Flag-RecQL5的常规HeLa细胞的Flag IP作为对照。星号表示污染蛋白质。（b） 显示面板a所示Flag IP输入、流通（FT）和洗脱液部分免疫印迹分析的放射自显影照片。（c）使用来自对照和表达FRecQL5的HeLa细胞的小鼠单克隆Pol II（8WG16）抗体从IP分离的RecQL5-Pol II复合物的银染SDS-PAGE凝胶。（d） 显示Pol II IP输入、流通（FT）和洗脱液部分免疫印迹分析的自动射线照片。使用8WG16（低磷酸化Pol IIa）、RecQL5、BLM和WRN抗体进行免疫印迹。（e和f）IP-Western分析表明，在用DNA损伤剂处理的细胞中，RecQL5和Pol II之间的关联没有显著改变。表达FRecQL5的HeLa细胞分别以30 nM CPT和1 mM羟基脲处理不同时间间隔（0至8 h）。蛋白质复合物通过Flag IP纯化，并用Flag和Pol II抗体进行免疫印迹。显示了免疫沉淀中Pol II和RecQL5之间的比率。
图2。
图2。
RecQL5通过两个保守域KIX和SRI域与Pol II相互作用。（a） Flag-RecQL5全长（FL）和截短形式的示意图。N端解旋酶和RecQ C端（RQC）结构域与新识别的KIX和SRI结构域一起显示。Pol II相互作用数据显示在右侧。（b至d）IP-Western分析显示不同RecQL5突变体和Pol II之间的关联。用模拟（仅pIRESneo-3）、全长和各种RecQL5缺失结构的表达质粒转染HEK293细胞。用Flag和Pol II（ARNA-3，识别低磷酸化和高磷酸化Pol II、IIa和IIo）抗体通过免疫印迹法分析Flag IP混合物。KIX构造是指含有501到650残基的蛋白质。SRI结构是指含有745到991残基的蛋白质。SRI结构域缺失突变体（ΔSRI）是指残基为1到900的结构体。
图3。
图3。
RecQL5-KIX域通过其他KIX域使用的通用接口与Pol IIa和Pol IIo进行交互。（a） 序列比对显示了RecQL5-KIX域和KIX域家族成员CBP、p300和Med15之间的相似性。KIX家族残基以绿色（保守的疏水核）、蓝色（非保守的疏水核心）和红色（额外保守的）突出显示。仅在RecQL5中保存的残留物为灰色。mCBP-KIX（PDB登录号1SB0）的二级结构如图所示（48）。底部的星号表示面板e中显示的保守RecQL5残基（灰色）。面板g和h中的突变显示在相应残基的下方。（b） RecQL5-KIX域的同调模型（2）(网址：www.pymol.org). （c） 疏水核心残留物（球体）如上文（a）所述并着色。（d） 保守氢键网络。显示了同源模型，RecQL5 R550和E584（青色）的保守侧链残基显示为棒状。图中显示了附近保守的疏水核心残留物（球体）。标签显示RecQL5（黑色）和mCBP（红色）残留物。（e） RecQL5-KIX保守表面。所示为带（左）和表面（右），带保守的非疏水性核心残留物（灰棒）（左）以及保守的疏水性核心残余物（白色球体[左]或绿色球体[右]，对应于a中的数据）。残留物按照上述（d）进行标记。h中突变的残基用星号标记。（f） mCBP-KIX（白色）-c-Myb（绿色）复合物（PDB登录号1SB0）（48）与红色蛋白质界面的比较（14，37）。沿着c-Myb界面的相应mCBP残留物按照上述（d）进行标记。（g） 标记IP和免疫印迹，以显示KIX域E584D点突变与Pol IIo和Pol IIa相关的缺陷。通过仅转染pIRESneo-3载体的HEK293细胞进行模拟IP。（h） IP-Western分析表明，KIX域中的不同点突变破坏了全长RecQL5和Pol II之间的关联。顶部显示了野生型（WT）和各种RecQL5突变体。Pol II Western blot下面的数字是由Flag-RecQL5抗体共同免疫沉淀的Pol IIa的相对量。与野生型RecQL5相关的PolⅡa的量被设置为“1”。（i）免疫印迹显示，只有RecQL5-KIX结构域与PolⅡ共免疫沉淀。星号表示污染蛋白质。
图4。
图4。
RecQL5-SRI域仅与Pol IIo相互作用，其结构类似于人类SRI域。（a） 序列比对表明，RecQL5和SetD2 SRI域之间具有很强的相似性。颜色用法如图3a的图例所示。人类SetD2-SRI（PDB登录号2A7O）的二级结构如图所示（27）(网址：www.pymol.org). 星号表示SetD2-SRI对Pol-IIo结合重要的残基。面板e和f中的突变显示在相应残基的下方。（b至d）RecQL5-SRI域的同调模型（2）。（c） 疏水性核心残留物（球体）如上文所述显示并着色，以便在面板a中对齐。（d）带状（左侧）和表面（右侧）模型中的保守RecQL5-SRI域表面。RecQL5和SetD2共享的保留残基显示为黑色（图a中的残基为红色）。pCTD相互作用残基显示为红色，侧链显示为青色（图a中的星号残基）。RecQL5残基用黑色标记，对应的SetD2残基用红色标记。（e）IP-Western分析表明，两个SRI结构域点突变破坏了它们与Pol IIo的关联。图3的图例描述了转染、抗体和模拟IP。（f） IP-Western分析表明，KIX和SRI结构域（E584D K939A和E584D-R943A）的同时突变破坏了它们与两种Pol II的关联。相反，KIX（E584D）中的单点突变仅破坏与Pol IIa的关联。采用全长野生型RecQL5（FL-WT）作为阳性对照。
图5：。
图5：。
RecQL5和Pol II之间的关联在鸡DT40细胞中是保守的。（a和b）RecQL5-KIX（a）和RecQL5-SRI（b）人和鸡保守的Pol II相互作用表面。（a） 人类RecQL5-KIX的带状模型如图3e的图例所示（白色球体，疏水核；棒状，Pol II相互作用表面；灰色带状，人与鸡之间的保守残基；白色带状，人和鸡之间的非保守残基）。（b） 人体RecQL5-SRI带状模型如图4d图例所示。颜色与上述（a）相对应。残留物标记如下：人类残留物为黑色，对应的鸡肉残留物是红色（与人类严格保守）、蓝色（与人类半保守）或绿色（与人类不保守）。（c） IP-Western分析显示，人类RecQL5在DT40细胞中共免疫沉淀Pol II。将标记的RecQL5野生型和不同突变体转染到土地管理局−/−/可回收QL5−/−DT40电池。蛋白质复合物由Flag-IP免疫沉淀，然后用Flag和Pol II抗体进行免疫印迹（IB）。（d） IP-Western分析显示，RecQL5与Rad51和PCNA在DT40细胞中共同免疫沉淀。对RecQL5、E584D、K58R和K58R的全长野生型（FL）和不同点突变体进行了测试。用Flag-IP免疫沉淀RecQL5蛋白复合物，并用Flag、Rad51、PCNA和Pol II抗体免疫印迹。
图6。
图6。
RecQL5抑制SCE和抵抗CPT诱导的细胞杀伤需要解旋酶活性和KIX域介导的Pol-IIa相互作用。（a） 总结不同人类RecQL5突变体及其与Pol II、解旋酶活性、SCE抑制和CPT抗性相关的相应活性。突变K58R的螺旋酶活性基于先前报告的数据（15）。抑制升高的SCE水平的能力基于面板b中的数据，而CPT抗性则基于面板c到面板e中的数据。SCE和CPT表型的部分校正用P表示。每个基因至少使用了两个克隆，以确保结果不是由克隆变异引起的。（b） 散点图显示SCE水平土地管理局−/−/RecQL5系列−/−如面板a所示，DT40细胞由RecQL5的野生型和各种突变体补充。每个点代表单个有丝分裂扩散中SCE的总数。每个突变体的每个细胞的SCE平均数显示出来，也用黑色条标记。“**”表示P（P）与对照细胞系相比<0.0001的值(土地管理局−/−)，由Mann-Whitney试验确定。“n.s.”不重要。每个细胞的SCE平均数是通过检查50个中期细胞中的三个可计数排列来确定的。一个例外是土地管理局−/−细胞，通过计数35个中期细胞获得。（c） 生存曲线仅显示土地管理局−/−/RecQL5系列−/−双突变DT40细胞显示出显著的CPT敏感性。（d和e）显示BLM CPT敏感性的生存曲线−/−/RecQL5系列−/−如图所示，DT40细胞由野生型（WT）和不同RecQL5突变体补充。如材料和方法所述，用指定浓度的药物处理DT40细胞。包括误差栏。
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