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.2010年3月；151(3):896-908.
doi:10.1210/en.2009-1116。 Epub 2010年2月10日。

细胞周期素依赖性激酶2的核靶向性揭示了细胞周期素依靠性激酶2定位和细胞周期素E在维生素D介导的生长抑制中的重要作用

奥马尔·弗洛雷斯 1, 王正英, 凯伦·克努森, 凯里·伯恩斯坦
附属公司

细胞周期素依赖性激酶2的核靶向性揭示了细胞周期素依靠性激酶2定位和细胞周期素E在维生素D介导的生长抑制中的重要作用

奥马尔·弗洛雷斯等。 内分泌学. 2010年3月.

摘要

1,25-二羟基维生素D（3）（1,25-（OH）（2）D（3。我们之前已经证明，1,25-（OH）（2）D（3）增加了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27（KIP1）的稳定性，降低了细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）的活性，并促进人类前列腺癌细胞中G（1）相的积累。这些效应与CDK2的细胞质重定位有关。在本研究中，我们研究了CDK2细胞质重定位在1,25-（OH）（2）D（3）抗增殖作用中的作用。CDK2被发现是前列腺癌细胞增殖所必需的。尽管由1,25-（OH）（2）D（3）诱导，但细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27（KIP1）对于1,25-（OH）（2）D（3）介导的生长抑制是可有可无的。CDK2活性降低1,25-（OH）（2）D（3）与T160磷酸化降低有关，T160磷酸化合残基的细胞核磷酸化对CDK2的活性至关重要。细胞周期蛋白E的异位表达足以克服1,25-（OH）（2）D（3）介导的CDK2细胞质定位错误和1,25-。同样，CDK2底物视网膜母细胞瘤的敲除导致细胞周期蛋白E上调，导致对1,25-（OH）（2）D（3）介导的生长抑制产生抵抗。人类前列腺癌细胞对1,25-（OH）（2）D（3）的生长抑制具有抵抗力，但保留了完全功能的维生素D受体。这些细胞没有表现出1,25-（OH）（2）D（3）介导的CDK2的细胞质再定位。靶向1,25-（OH）（2）D（3）敏感癌细胞的细胞核的CDK2阻断了1,25-。这些数据确立了CDK2核质转运和细胞周期蛋白E在前列腺癌细胞中1,25-（OH）（2）D（3）介导的生长抑制机制中的中心作用。

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图1
图1
CDK2是LNCaP细胞最大增殖所必需的。LNCaP细胞感染shCDK2或对照shLuciferase。A、 收集细胞裂解产物，通过Western blotting检测CDK2和肌动蛋白。这是四个实验的代表。B、 用50 nm 1,25-（OH）处理72 h后计数细胞2D类三或EtOH车辆。实验一式三份。细胞以每孔50000个细胞的速度进行电镀。数据结合了三个实验，使用平均细胞数±sem（***，P（P）< 0.001).
图2
图2
1,25-（OH）不需要p272D类三-介导的生长抑制。A、 用50 nm 1,25-（OH）处理LNCaP细胞2D类三或EtOH载体对照72小时。收集细胞裂解物，通过Western blotting检测p27和肌动蛋白。B、 LNCaP细胞感染shp27或对照shLuciferase。感染72小时后，收集细胞裂解物，通过Western blotting检测p27和肌动蛋白。图像来自相同的污点和相同的曝光时间。C、 LNCaP细胞感染shp27或对照shLuciferase。感染48小时后，用50 nm 1,25-（OH）处理细胞2D类三或EtOH载体72h，并测定细胞数。实验一式三份（平均细胞数±sem；**，P（P）< 0.01; *,P（P）< 0.05). 蛋白质印迹和增殖分析是三个实验的代表。
图3
图3
1,25-（OH）2D类三降低CDK2活性和CDK2T160磷酸化。用50 nm 1,25-（OH）处理LNCaP细胞2D类三或EtOH载体控制72小时。A，收集细胞裂解物，并在体外使用兔抗CDK2抗体进行CDK2激酶检测，以获得CDK2免疫复合物，组蛋白H1是反应的底物。B、 蛋白质印迹法检测磷酸化-T160 CDK2、CDK2和肌动蛋白。蛋白质印迹和激酶分析是三个实验的代表。
图4
图4
细胞周期蛋白E水平和CDK2/Cyclin E结合不受1,25-（OH）的影响2D类三用50 nm 1,25-（OH）处理LNCaP细胞2D类三或EtOH载体72小时后，收集细胞裂解物，通过Western blotting检测细胞周期蛋白E和肌动蛋白。B、，上部面板用兔抗CDK2抗体分离CDK2免疫复合物，并用SDS-PAGE进行分离。IgG被用作免疫沉淀的对照。Western blotting检测CDK2和cyclin E。下部面板使用50μg LNCaP细胞裂解物通过Western blotting检测输入细胞周期蛋白E和肌动蛋白。显示了三个实验的代表性斑点。
图5
图5
细胞周期蛋白E1表达克服1,25-（OH）2D类三-介导的抗增殖作用。A、 用GFP或cyclin E1–3XFLAG慢病毒构建物感染LNCaP细胞。感染后48小时，用50 nm 1,25-（OH）处理细胞2D类三或EtOH载体72小时，然后使用CDK2抗体进行免疫荧光染色(红色)或FLAG(绿色)或直接可视化GFP。为了染色细胞核，细胞也与4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色). 使用共焦显微镜观察图像。B、 CDK2染色的荧光强度通过共焦显微镜图像上的ImageJ软件进行量化。计算GFP阳性细胞的核与总CDK2荧光强度的比值，并在各治疗组之间进行比较。(***,P（P）< 0.001). C、 通过G418筛选获得表达各种慢病毒结构的细胞。用50 n米1,25-（OH）2D类三或EtOH载体72小时。测定细胞数量并计算细胞增殖的抑制百分比。数据代表了三次实验，一式三份（平均抑制百分比±扫描电镜). D、 LNCaP/GFP、LNCaP/cyclin E1–3XFLAG或LNCaP/KD-E-3XFLAG细胞用50 n米1,25-（OH）2D类三或EtOH载体72h。细胞用BrdU染色。实验一式三份，数据表示细胞周期每个阶段的平均细胞百分比±扫描电镜是三个实验的代表。E、 50 n处理72小时后进行实时PCR米1,25-（OH）2D类三对CYP24A1使用Taqman探针并归一化为18S（对照）。该实验一式三份，是三个实验的代表。误差线,标准偏差.
图6
图6
Rb击倒克服1,25-（OH）2D类三-介导的生长抑制。A、 用50 nm 1,25-（OH）处理表达短发夹RB或EV对照的LNCaP细胞2D类三或EtOH载体72h，并测定细胞数。实验一式三份（平均细胞数±sem；***，P（P）<0.001），是三个实验的代表。B、 在50 n剂量治疗24小时后进行实时PCR米1,25-（OH）2D类三对CYP24A1使用Taqman探针并归一化为18S（对照）。实验进行了三次，共三次。数据表示车辆控制的平均折叠感应±扫描电镜.
图7
图7
1,25-（OH）的表征2D类三-耐药LNCaP细胞。细胞对1,25-（OH）敏感（LNCaP-Con.R）和不敏感（LNCaP-VitD.R）2D类三用50 nm 1,25-（OH）处理2D类三或EtOH车辆5天，除非另有说明。A、 治疗五天后，测定细胞数量。实验一式三份。数据表示平均细胞数±sem，并且代表三个实验（**，P（P）< 0.01). B、 用BrdU对细胞进行染色。实验一式三份。数据表示细胞周期每个阶段的平均百分比±扫描电镜是两个实验的代表。C、 收获细胞裂解物，并通过蛋白质印迹检测VDR和肌动蛋白蛋白，这是五个实验的代表。D、 50天后进行实时PCR米1,25-（OH）2D类三对CYP24A1使用Taqman探针并归一化为18S（对照）。实验进行了三次，共三次。数据表示车辆控制的平均折叠感应±扫描电镜.E、LNCaP Con.R或LNCaP-VitD。用50 n米1,25-（OH）2D类三或EtOH载体对照5天，然后进行免疫荧光染色，这是三个实验的代表。
图8
图8
CDK2的核靶向性克服1,25-（OH）2D类三-介导的抗增殖作用。A、 CDK2-NLS示意图-myc公司和CDK2-myc公司构造。B、 G418选择的LNCaP/CDK2-NLS-myc和LNCaP-GFP细胞在50 n处理后24 h和72 h被镀在盖玻片上米1,25-（OH）2D类三或EtOH载体对照，对细胞进行免疫荧光染色，代表三个实验。C、 LNCaP/CDK2-NLS-myc和对照LNCaP/GFP细胞用50 n米1,25-（OH）2D类三或EtOH载体对照72h。细胞用BrdU染色。实验一式三份。数据表示细胞周期每个阶段的平均百分比±扫描电镜是三个实验的代表。D、 G418选择的LNCaP细胞用50 n米1,25-（OH）2D类三或EtOH溶媒对照72小时，测定细胞数。这些数据代表了三次实验的结果（平均抑制百分比±扫描电镜)T160ACDK2-NLS除外-myc公司，表示两个一式三份的实验（实验范围T160ACDK2-NLS-myc 55.8–59.7）。E、 G418-选择的LNCaP细胞用50 n米1,25-（OH）2D类三或EtOH载体控制72小时。收集细胞裂解物并在体外CDK2激酶活性测定使用小鼠抗-myc公司获得CDK2-NLS的抗体-myc公司和CDK2-myc公司免疫复合物和组蛋白H1是反应的底物。CDK2-NLS公司-myc公司或CDK2-myc公司通过蛋白质印迹检测反应中的蛋白质水平，并且代表三个实验。
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