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.2009年12月14日；4（12）：e8285。
doi:10.1371/journal.pone.0008285。

磷脂酰肌醇3-激酶/磷脂酶Cgamma1途径调节成纤维细胞生长因子诱导的毛细血管形成

塔妮娅·马福奇 1, 克劳迪奥·雷蒙迪, 沙迪·阿布·哈耶赫, 维罗妮卡·多明格斯, 吉安卢卡·萨拉, 伊恩·扎卡里, 马可·法拉斯卡
附属公司

磷脂酰肌醇3-激酶/磷脂酶Cgamma1途径调节成纤维细胞生长因子诱导的毛细血管形成

塔妮娅·马福奇等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：成纤维细胞生长因子（FGF）是胚胎发育、组织稳态和肿瘤血管生成的关键调节因子。FGF与其受体的结合导致几个细胞内信号级联的激活，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷脂酶C（PLC）γ1。在这里，我们研究了碱性FGF（FGF-2）介导的这些酶在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的激活，并确定了它们在FGF-2依赖性细胞功能中的作用。

方法/主要发现：我们通过对细胞代谢标记和细胞内钙增加后肌醇磷酸总生成量的分析，发现FGF-2激活了HUVEC中的PLCgamma1。我们进一步证明FGF-2激活PI3K，通过TLC和共焦显微镜分析其脂质产物磷脂酰肌醇-3,4,5-P（3）的积累进行评估。PI3K活性是FGF-2诱导的PLCgamma1激活所必需的，PI3K/PLCgamma1通路参与FGF-2依赖的细胞迁移，这是通过Transwell分析测定的，并参与FGF-2-诱导的毛细血管形成（体外小管生成分析）。最后，我们发现PI3K依赖的PLCgamma1激活调节FGF-2介导的Akt残基Ser473的磷酸化，这是通过Western blotting分析确定的。这通过蛋白激酶C（PKC）α激活发生，因为使用特定siRNA下调PKCalpha表达或使用化学抑制阻断其活性会影响FGF-2依赖性Ser473 Akt磷酸化。此外，PKCalpha的抑制可阻断FGF-2依赖性细胞迁移。

结论/意义：这些数据阐明了PLCgamma1在HUVEC中FGF-2信号传导中的作用，证明了其在FGF-2依赖性小管生成中的关键作用。此外，这些数据揭示了PLCgamma1作为PI3K依赖性Akt激活的介体和作为不同Akt依赖性过程的新型关键调节器的新作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。FGF-2激活EC中的PLCγ1。
（A） 用干扰siRNA或特异siRNA转染HUVEC，下调PLCγ1的表达。24小时后，用[三H] 在含有2%FBS的M199中的肌醇再刺激24小时，然后用100ng/ml FGF-2刺激指定的时间。数据表明在指定时间内生成的肌醇磷酸盐总量，并以基础肌醇磷酸盐的百分比表示。数据是从5个独立实验中获得的值的平均值±SEM*p<0.05，**p<0.01。Blot显示PLCγ1在转染有对照干扰siRNA或靶向PLCγ1的siRNA的HUVEC裂解物中的表达。通过使用抗肌动蛋白抗体来评估蛋白质的相等负载。（B） 按照材料和方法课程中的描述，测定血清缺乏的HUVEC中细胞内钙的增加。在指定的时间用100 ng/ml FGF-2和1 mM ATP刺激细胞（箭头所示）。数据是从4个独立实验中获得的值的平均值。（C） 转染所示siRNA的HUVEC中PLCγ1或PLCγ2的表达水平。使用抗Akt或抗ERK抗体确认负载量相等。（D） 用打乱的siRNA或靶向PLCγ1或PLCγ2的siRNA转染HUVEC。转染24小时或48小时后通过人工计数确定细胞数量。数据表示为每个时间点用打乱siRNA转染的细胞百分比，是6个独立实验所得值的平均值±SEM*与表达siRNA PLCγ1的HUVEC相比，p<0.05，**p<0.01。在C和D中，靶向PLC的siRNAγ2来自Dharmacon。
图2
图2。FGF-2在涉及PI3K激活的机制中激活PLCγ1。
（A） HUVEC标记有[三H] 肌醇24小时，然后用10µM LY294002预处理15分钟，然后用100 ng/ml FGF-2刺激。数据表明在指定时间内生成的肌醇磷酸盐总量，并以基础肌醇磷酸盐的百分比表示。数据是从9个独立实验中获得的值的平均值±SEM*p<0.05。（B） 未经处理或用10µM LY294002处理的血清饥饿HUVEC的钙释放。在指定的时间用100 ng/ml FGF-2和1 mM ATP刺激细胞（箭头所示）。数据是两个独立实验所得值的平均值。
图3
图3。FGF-2激活HUVEC中的PI3K。
（A） 提取磷脂的薄层色谱分析[32P] -标记的HUVEC用100 ng/ml FGF-2刺激指定时间或1µM 1-磷酸鞘氨醇（S1P）刺激5分钟。箭头表示PtdIns-3,4,5-P三点。（B） 在使用100 ng/ml FGF-2刺激之前，将生长在玻璃盖玻片上的HUVEC在M199+0.5%FBS中培养过夜，培养时间为指定时间。然后用抗PtdIns-3,4,5-P培养盖玻片三抗体，并通过共聚焦显微镜进行分析。箭头表示磷酸肌醇的质膜定位。酒吧 = 10微米。
图4
图4。PLCγ1是FGF-2诱导的细胞迁移所必需的。
（A） HUVEC在M199+0.5%FBS中培养过夜，然后用5µM U73122或U73343处理30分钟。通过Transwell分析评估细胞在100 ng/ml FGF-2存在下的迁移。数据是从7个独立实验获得的值的平均值±SEM，表示为在没有FGF-2（对照）的情况下迁移的细胞百分比***p<0.001。（B） 用干扰siRNA或siRNA转染HUVEC，下调PLCγ1的表达。24小时后，将细胞在M199+0.5%FBS中培养过夜。然后通过Transwell分析评估细胞在100 ng/ml FGF-2存在下的迁移。数据是7-10个独立实验所得值的平均值±SEM*p<0.05。
图5
图5。PLCγ1对FGF-2诱导的小管生成是必需的在体外.
（A） 在没有或存在FGF-2以及2µM PLC抑制剂U73122或其非活性类似物U73343的情况下，Matrigel上HUVEC的代表性图像。图表示通过计算五个字段的分支点数量获得的实验的定量分析。数据是从12个独立实验中获得的值的平均值±SEM。**p<0.01。NS公司 = 不重要。（B） 在Matrigel上转染干扰siRNA或靶向PLCγ1的siRNA的HUVEC代表性图像，存在FGF-2。定量分析显示数据为5个独立实验所得值的平均值±SEM。NS公司 = 不重要。
图6
图6。PLCγ1依赖性PKCα激活介导FGF-2诱导的Akt激活。
HUVEC在M199+0.5%的FBS中培养过夜，然后用指示浓度的U73122或U73343处理30分钟（A）或10µM的传统PKC抑制剂Gö6976（B），然后用100 ng/ml FGF-2刺激10分钟（C）。24小时后，隔夜剥夺细胞血清，然后用100 ng/ml FGF-2刺激指定时间。使用特定抗体评估Ser473的Akt磷酸化。然后剥离膜，并用抗Akt抗体进行再防腐。印迹是7（A）和3（B，C）独立实验的代表。在所有情况下，都对谱带强度进行了定量分析。数据表示pSer473 Akt/Akt的值，表示为对照组的倍数增加。
图7
图7。PKCα是FGF-2诱导细胞迁移所必需的。
（A） 在分别用2µM Gö6796、50µM或10µM的MEK抑制剂PD98059和U0126或50µM的Akt抑制剂SH5处理HUVEC之前，在M199+0.5%FBS中培养过夜。然后通过Transwell分析评估细胞在100 ng/ml FGF-2存在下的迁移。数据是2-7个独立实验所得值的平均值±SEM*p<0.05，**p<0.01。（B） 用扰乱的siRNA或siRNA转染HUVEC以下调PKCα的表达。24小时后，将细胞在M199+0.5%FBS中孵育过夜。然后通过Transwell测定评估细胞在100ng/ml FGF-2存在下的迁移。数据是从5个独立实验中获得的值的平均值±SEM**p<0.01。
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