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.2010年1月15日;44(1):7-15.
doi:10.1016/j.bcmd.2009.10.002。 Epub 2009年10月27日。

cJun通过上游cAMP反应元件调节Ggamma-globin基因表达

附属公司

cJun通过上游cAMP反应元件调节Ggamma-globin基因表达

Sirisha Kodeboyina公司等。 血细胞分子疾病. .

摘要

先前研究表明,上游Ggamma-globin基因cAMP反应元件(G-CRE)在药物介导的胎儿血红蛋白诱导中发挥作用。这种作用是通过p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)依赖的CREB1、ATF-2磷酸化和G-CRE反式激活实现的。由于该基序也是cJun的一个预测一致性结合位点,我们扩展了我们的分析,以确定cJun通过G-CRE交易私有γ-球蛋白的能力。通过染色质免疫沉淀分析,我们发现体内cJun和CREB1与G-CRE区域的结合具有可比性。证实了cJun/ATF-2和CREB1/ATF-2之间的蛋白质相互作用,但CREB1和cJun之间没有相互作用。然而,我们通过电泳迁移率偏移分析在体外观察到cJun和CREB1与G-CRE结合。启动子下拉分析和序列western blot分析证实cJun、CREB1和ATF-2在G-CRE上共定位。为了显示功能相关性,完成了pLen-cJun和Ggamma-promotor(-1500至+36)荧光素酶报告子的强制表达研究;我们观察到pLen-cJun荧光素酶活性的浓度依赖性增加,类似于CREB1强制表达产生的荧光酶活性。此外,G-CRE中-1225处的G/A突变消除了cJun反式激活。最后,在K562细胞和正常原代红细胞祖细胞中强制表达cJun可增强内源性γ-球蛋白基因的表达。我们的结论是,这些数据表明cJun通过G-CRE以与CREB1类似的方式激活Ggamma-globin启动子,并基于G-CRE中的DNA-蛋白质相互作用提出了一个γ-globin激活模型。

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数字

图1
图1。cJun和CREB1结合G-CRE区体内
在K562细胞中进行ChIP分析,以确定cJun和CREB1与Gγ-珠蛋白CRE(G-CRE)区域的结合体内A)使用图中所示的两组引物进行定量PCR(qPCR),以验证Gγ-珠蛋白启动子中的染色质富集。引物I和II以-53到+69区域为靶点,以确认TFIID与TATA盒的结合,而引物III和IV用于测量G-CRE区域的染色质富集。B) 未经处理的K562细胞(-)或用2 mM NaB或0.5μM TSA(+)处理后的ChIP检测定量结果如图所示。来自qPCR分析的数据被绘制为用所示抗体进行的免疫沉淀反应的染色质富集的倍数变化。无抗体(no AB)和IgG样本用作对照。无AB样品的染色质富集水平归一化为1。数据显示为平均值的平均值±标准误差(SEM),*p<0.05被认为是显著的(**p<0.01和***p<0.001)。
图2
图2。药物治疗后cJun和CREB1磷酸化水平增加
从用NaB(2 mM)或TSA(0.5μM)处理48小时的K562细胞中分离出蛋白质提取物(见材料)。A) 所示为用磷酸化cJun(p-cJun)和total-cJun(t-cJun)抗体进行的蛋白质印迹。B) 显示了p-CREB1和t-CREB1抗体的Western blot分析结果。C) 图中显示了使用ChemiDoc软件(Biorad)从western印迹凝胶获得的定量数据。显示了在没有(-)或(+)药物治疗的情况下,p-CREB1/t-CREB1(黑色条)和p-cJun/t-cJun(灰色条)蛋白质水平。数据显示为平均值±SEM,*p<0.05被视为显著。
图3
图3。cJun与CREB1和ATF-2共同定位于G-CRE
A) 用200-300μg K562核提取物和t-CREB1、t-cJun、t-ATF-2和IgG抗体进行免疫沉淀(IP)反应,然后用单独的膜和抗体进行western blot(WB),以检测蛋白-蛋白质相互作用(见材料)。注意,当IP和WB抗体作为阳性对照相同时,存在一条蛋白带。带有IgG的IP作为阴性对照,没有产生预期的蛋白带。B) 用K562细胞核提取物(NE)和G-CRE探针进行电泳迁移率变化分析(EMSA)。显示了在不存在(泳道1)或存在8μg K562 NE(泳道2-5)的情况下的不同反应。使用t-CREB1和t-cJun抗体进行超移位分析。C) EMSA是在与B组所述相同的条件下进行的,除了与突变探针G-m1(G/A)、G-m2(AC/TG)和G-m3与加扰G-CRE(tctctgta)的反应。在NE和冷寡核苷酸(++)存在下完成竞争反应,以确定结合的特异性。D) 用2μg 5′-生物素化g-CRE探针和300μg从K562细胞制备的核提取物进行启动子下拉反应。对增加的链霉亲和素珠(beads)进行分析,以测试复合下拉的效率。用t-CREB1和t-cJun抗体进行western blotting检测与G-CRE结合的蛋白质(见材料)。核提取物(输入NE)用作阳性对照。t-cJun蛋白印迹显示非特异性(NS)蛋白带。E) 使用面板D中所述的5′生物素化G-CRE和G-m2(AC/TG)突变探针进行启动子下拉,但在所有反应中使用20μl链霉亲和素琼脂糖珠。用总ATF-2(t-ATF-2)抗体进行Western blot分析。显示了在没有生物素化探针(珠)的情况下进行的阴性对照反应。
图3
图3。cJun与CREB1和ATF-2共同定位于G-CRE
A) 用200-300μg K562核提取物和t-CREB1、t-cJun、t-ATF-2和IgG抗体进行免疫沉淀(IP)反应,然后用分离的膜进行蛋白质印迹(WB),抗体显示可检测蛋白质-蛋白质相互作用(见材料)。注意,当IP和WB抗体作为阳性对照相同时,存在一条蛋白带。带有IgG的IP作为阴性对照,没有产生预期的蛋白带。B) 用K562细胞核提取物(NE)和G-CRE探针进行电泳迁移率变化分析(EMSA)。显示了K562 NE缺乏(通道1)或存在8μg时的不同反应(通道2-5)。使用t-CREB1和t-cJun抗体进行超移位分析。C) EMSA是在与B组所述相同的条件下进行的,除了与突变探针G-m1(G/A)、G-m2(AC/TG)和G-m3与加扰G-CRE(tctctgta)的反应。在NE和冷寡核苷酸(++)存在下完成竞争反应,以确定结合的特异性。D) 用2μg 5′-生物素化g-CRE探针和300μg从K562细胞制备的核提取物进行启动子下拉反应。对增加的链霉亲和素珠(beads)进行分析,以测试复合下拉的效率。用t-CREB1和t-cJun抗体进行western blotting检测与G-CRE结合的蛋白质(见材料)。核提取物(输入NE)用作阳性对照。t-cJun蛋白印迹显示非特异性(NS)蛋白带。E) 使用面板D中所述的5′生物素化G-CRE和G-m2(AC/TG)突变探针进行启动子下拉,但在所有反应中使用20μl链霉亲和素琼脂糖珠。用总ATF-2(t-ATF-2)抗体进行Western blot分析。显示了在没有生物素化探针(珠)的情况下进行的阴性对照反应。
图3
图3。cJun与CREB1和ATF-2共同定位于G-CRE
A) 用200-300μg K562核提取物和t-CREB1、t-cJun、t-ATF-2和IgG抗体进行免疫沉淀(IP)反应,然后用单独的膜和抗体进行western blot(WB),以检测蛋白-蛋白质相互作用(见材料)。注意,当IP和WB抗体作为阳性对照相同时,存在一条蛋白带。具有IgG的IP作为阴性对照,并且没有产生预期的蛋白带。B) 用K562细胞核提取物(NE)和G-CRE探针进行电泳迁移率变化分析(EMSA)。显示了K562 NE缺乏(通道1)或存在8μg时的不同反应(通道2-5)。使用t-CREB1和t-cJun抗体进行超移位分析。C) EMSA是在与B组所述相同的条件下进行的,除了与突变探针G-m1(G/A)、G-m2(AC/TG)和G-m3与加扰G-CRE(tctctgta)的反应。在NE和冷寡核苷酸(++)存在下完成竞争反应,以确定结合的特异性。D) 用2μg 5′-生物素化g-CRE探针和300μg从K562细胞制备的核提取物进行启动子下拉反应。对增加的链霉亲和素珠(beads)进行分析,以测试复合下拉的效率。用t-CREB1和t-cJun抗体进行western blotting检测与G-CRE结合的蛋白质(见材料)。核提取物(输入NE)用作阳性对照。t-cJun蛋白印迹显示非特异性(NS)蛋白带。E) 如图D所述,用5′生物素化G-CRE和G-m2(AC/TG)突变探针进行启动子下拉,但在所有反应中使用20μl链亲和素琼脂糖珠除外。用总ATF-2(t-ATF-2)抗体进行Western blot分析。显示了在没有生物素化探针(珠)的情况下进行的阴性对照反应。
图4
图4。cJun和CREB1竞争Gγ-珠蛋白启动子的反激活
A) 图示为携带1536 bp与荧光素酶报告基因相连的野生型Gγ-珠蛋白启动子的Gγ-Luc质粒的示意图。B) 使用与cJun表达载体pLen-cJun浓度增加共同转染的Gγ-Luc报告基因对K562细胞进行瞬时转染分析。所示为减去通过pLen空载体控制进行转染获得的荧光素酶值后的荧光素酶活性。数据显示为平均值±SEM,*p<0.05被视为显著(**p<0.01;**p<0.001)。C) 对pCMV-CREB1表达载体和相应的空载体控制pCMV进行了类似实验。所示为荧光素酶定量数据。D) 用30μg的pCMV-CREB1(黑条)或pLen-cJun(灰条)载体单独(+)或两种载体组合(条纹条;++)进行共转染实验。所示为不同条件下的相对荧光素酶活性。
图4
图4。cJun和CREB1竞争Gγ-珠蛋白启动子的反激活
A) 图示为携带1536 bp与荧光素酶报告基因相连的野生型Gγ-珠蛋白启动子的Gγ-Luc质粒的示意图。B) 使用与cJun表达载体pLen-cJun浓度增加共同转染的Gγ-Luc报告基因对K562细胞进行瞬时转染分析。所示为减去通过pLen空载体控制进行转染获得的荧光素酶值后的荧光素酶活性。数据显示为平均值±SEM,*p<0.05被视为显著(**p<0.01;**p<0.001)。C) 对pCMV-CREB1表达载体和相应的空载体控制pCMV进行了类似实验。所示为荧光素酶定量数据。D) 用30μg的pCMV-CREB1(黑条)或pLen-cJun(灰条)载体单独(+)或两种载体组合(条纹条;++)进行共转染实验。所示为不同条件下的相对荧光素酶活性。
图5
图5。Gγ-珠蛋白启动子转激活需要完整的G-CRE
A) 在K562细胞中使用野生型(Gγluc)和突变型Gγlus(m1)、Gγlux(m2)和Gγlud(m3)报告基因构建物进行瞬时转染分析(见材料)。B) 使用在A组和pLen-cJun或pCMV-CREB1表达载体中测试的相同报告质粒进行共转染研究。相应的空载体pLen和pCMV被用作各自的对照。
图5
图5。Gγ-珠蛋白启动子转激活需要完整的G-CRE
A) 在K562细胞中用野生型(Gγluc)和突变型Gγluc(m1)、Gγluc(m2)和Gγluc(m3)报告构建体进行瞬时转染测定(见材料)。B) 使用在A组和pLen-cJun或pCMV-CREB1表达载体中测试的相同报告质粒进行共转染研究。相应的空载体pLen和pCMV被用作各自的对照。
图6
图6。稳定的cJun表达增强γ-珠蛋白转录
使用pLen-cJun和pCMV-CREB1表达载体以及相应的空载体对照在K562细胞中建立稳定的细胞系(见材料)。A) 用从带有t-cJun抗体的三个稳定株系中分离的蛋白提取物进行Western blot,以确认稳定的强制表达。膜被剥离并用肌动蛋白抗体进行探测,作为内部对照。B) 强制cJun表达对内源性γ-珠蛋白基因表达的影响通过γ-珠基因特异性引物的qPCR分析进行测量(表1)。所示为pLen-cJun载体拷贝数校正的γ/GAPD mRNA比率。C) 用从三个稳定株系中分离的蛋白和t-CREB1抗体进行Western blot,以确认t-CREB的稳定表达。D) 所示为pCMV-CREB1载体拷贝数校正的γ/GAPD mRNA比率。
图6
图6。稳定的cJun表达增强γ-珠蛋白转录
使用pLen-cJun和pCMV-CREB1表达载体以及相应的空载体对照在K562细胞中建立稳定的细胞系(见材料)。A) 用从带有t-cJun抗体的三个稳定株系中分离的蛋白提取物进行Western blot,以确认稳定的强制表达。膜被剥离并用肌动蛋白抗体进行探测,作为内部对照。B) 强制cJun表达对内源性γ-珠蛋白基因表达的影响通过γ-珠基因特异性引物的qPCR分析进行测量(表1)。所示为pLen-cJun载体拷贝数校正的γ/GAPD mRNA比率。C) 用从三个稳定株系中分离的蛋白和t-CREB1抗体进行Western blot,以确认t-CREB的稳定表达。D) 所示为pCMV-CREB1载体拷贝数校正的γ/GAPD mRNA比率。
图7
图7。增强cJun和CREB1表达增加原代红细胞γ-珠蛋白转录
红系祖细胞是在双相液体培养系统中从外周血单个核细胞中培养出来的(见材料)。在培养第11天的48小时和72小时中执行pLen-cJun和pCMV-CREB1的强制表达。使用空pLen和pCMCV载体作为非特异性效应的对照。在qPCR分析指定的时间分离RNA。

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工具书类

    1. Stamatoyannopoulos G.发育和红细胞分化期间珠蛋白基因表达的控制。实验血液学。2005;3:259–71.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Chakalova L、Carter D、Debrand E等。β-珠蛋白基因位点的发育调控。Prog分子亚细胞生物学。2005:183–206.-公共医学
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