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比较研究
.2009年8月11日;106(32):13254-9.
doi:10.1073/pnas.0906208106。 Epub 2009年7月23日。

人类BRCA2的BRC重复序列差异调节RAD51与单链与双链DNA的结合,以刺激链交换

附属公司
比较研究

人类BRCA2的BRC重复序列差异调节RAD51与单链与双链DNA的结合,以刺激链交换

马哈茂德·克什夫吉等。 美国国家科学院程序. .

摘要

乳腺癌和卵巢癌抑制因子BRCA2在同源DNA重组(HDR)期间控制RAD51酶以保持基因组稳定性。BRCA2通过分散在1127残基区(BRCA2([BRC1-8]))的8个保守BRC重复序列基序与RAD51结合。在这里,我们表明BRCA2([BRC1-8])对RAD51与单链(ss)和双链(ds)DNA底物的结合产生相反的作用,增强了链交换。电子显微镜显示,BRCA2([BRC1-8])改变了与ssDNA底物结合的RAD51的电泳迁移率,同时增加了ssDNA-结合蛋白的组装。单分子荧光光谱显示,BRCA2([BRC1-8])促进RAD51加载到ssDNA上。相反,BRCA2([BRC1-8])对dsDNA上RAD51组装有不同的影响;它抑制并减缓了这个过程。当同源ssDNA和dsDNA都存在时,BRCA2([BRC1-8])刺激链交换,延迟RAD51加载到dsDNA上,同时出现代表重组产物的接头分子。总之,我们的研究结果表明,BRCA2([BRC1-8])靶向RAD51至ssDNA,同时抑制dsDNA的结合,并且这些对比活性共同促进彼此刺激HDR。我们的工作为人类HDR的机制及其BRCA2肿瘤抑制因子的调节提供了新的见解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明:编辑和A.V.最近(2009年3月)就相关主题合著了一篇论文。

数字

图1。
图1。
BRCA2改变了RAD51复合物在切除的dsDNA底物上的电泳迁移率[BRC1–8]. (A类)EMSA用于检测BRCA2之间关联的方案和试剂的示意图[BRC1–8]RAD51,并在存在RPA和ATP的情况下切除dsDNA。(B类)RAD51在切除的dsDNA底物上形成复合物,通过增加BRCA2的浓度在EMSA中进一步延缓[BRC1–8]表明形成了共生复合物。在没有BRCA2或BRCA2浓度增加的情况下,在添加3.3μM RAD51之前,将放射性标记的切除dsDNA(10μM)与0.07μM RPA预混合[BRC1–8](0.4–1.6μM;3–6道)与含有1 mM ATP的反应反应,并在37°C下培养60分钟。蛋白质-DNA复合物通过凝胶电泳分离并通过磷光成像分析。在RAD51存在的情况下,切除的dsDNA的流动性被分解为一个扩散带(通道2)。增加BRCA2浓度[BRC1–8]进一步延缓RAD51分离的dsDNA复合物(3–6通道)。放射性标记的切除dsDNA的流动性在通道1中表示为未结合(UB)。请注意,图中和图中的车道2-6图S2从相同的原始凝胶中分离出来,并且巷1已经被复制。
图2。
图2。
存在或不存在BRCA2时RAD51-ssDNA组装体的EM可视化[BRC1–8]RAD51(5μM)与15μMφX174圆形ssDNA孵育(A类)或存在(B类)2μM BRCA2[BRC1–8]在37°C下,在含有ATP的反应混合物中放置15分钟。用1%醋酸铀酰染色后,对网格进行蛋白质-DNA复合物分析。没有BRCA2[BRC1–8]EM可视化显示RAD51的DNA结合组装很少,但大量低聚物RAD51环(黑色箭头)明显不含DNA(相比之下A类1和B类1). 巴西航空公司2【BRC1–8】显著减少了低聚RAD51环的数量。这伴随着ssDNA结合蛋白组装体的增加,其表现为广泛聚集的团块。(比例尺,100 nm)定量(参见SI方法)比较环所占面积与围绕丝状物的面积之比,发现其减少了11倍。
图3。
图3。
BRCA2的影响[BRC1–8]TCCD测量的RAD51-ssDNA关联。(A类)RAD51-Atto647N(红色)和Alexa488-ss/dsDNA(蓝色)的单分子爆发。两个通道中的同时爆发表明存在RAD51-DNA复合物通过探针体积扩散。RAD51-Atto647N(3.3μM)单独使用或使用1.2μM BRCA2[BRC1–8]或2 mM Ca2+离子与10μM Alexa488-ssDNA孵育以测量(B类)Alexa488-ssDNA荧光爆发的分数,显示同时发生的RAD51-Atto647N爆发(根据探测器效率进行校正),以及(C类)RAD51-Atto647N和Alexa488-ssDNA同时爆发时观察到的平均强度比。钙离子可以稳定DNA(25)上的RAD51细丝,并在TCCD实验中用作阳性对照。
图4。
图4。
巴西航空公司2[BRC1–8]延迟dsDNA上的RAD51组装。(A类)的示意图Afl公司III放射性标记的限制性内切酶消化模式阿帕LI-线性化ΦX174 dsDNA。(B类)将放射性标记的dsDNA(7μM)在37°C下与AMP-PNP在无RAD51(0.5–4.0μM;2–7道)或RAD51浓度增加的情况下培养60分钟。去除一半反应物并与EMSA的凝胶负载缓冲液混合,而另一半用10 U处理Afl公司III在37°C下持续15分钟,然后进行脱蛋白。这个Afl公司III消化模式(上部)然后直接与三元络合物的形成进行比较(下部). 随着RAD51浓度的增加,三元络合物的迁移逐渐减缓,并与Afl公司III消化dsDNA(比较车道1和车道2-7)。注意,只有放射性标记的末端碎片在通道1中可见(828和2632 bp);中心片段未标记,只能在部分摘要中看到。放射性标记的线性dsDNA单独(通道1)标记为UB。(C类)巴西航空公司2[BRC1–8]延迟dsDNA上的RAD51组装。除使用ATP代替AMP-PNP和BRCA2外,反应的组装和分析如上所述[BRC1–8]以指定浓度添加(车道5–16)。然而,3.3μM RAD51在dsDNA上快速而完全地组装,提供了免受限制性消化的保护,添加了1–1.9μM BRCA2[BRC1–8]以与浓度相关的方式延迟组装。单分子荧光数据,其中3.3μM RAD51-Atto647N单独或存在1.2μM BRCA2[BRC1–8]或2 mM Ca2+离子与10μM Alexa488-dsDNA孵育7.5分钟(暗)和15分钟(光)以测量(D类)Alexa488-dsDNA荧光爆发的分数,显示同时发生的RAD51-Atto647N爆发(根据探测器效率进行校正),以及(E类)RAD51-Atto647N和Alexa488-dsDNA同时爆发时观察到的平均强度比。
图5。
图5。
巴西航空公司2[BRC1–8]刺激RAD51介导的链交换,同时延迟RAD51-dsDNA组装。在BRCA2存在或不存在的情况下,组装了由3.3μM RAD51介导的10μM切除dsDNA和7μM同源dsDNA之间的链交换反应[BRC1–8]. (A类)dsDNA底物经过放射性标记,可以通过保护来监测dsDNA上的RAD51组装Afl公司III消化,如图4所示。(B类C类)对切除的dsDNA底物进行标记,以便检测重组的联合分子产物。无BRCA2【BRC1–8】(A类,泳道1-4),RAD51对dsDNA的快速保护在0-7.5分钟之间是明显的;并且无法检测到接头分子(jm)的形成(B类,1-5车道)。相比之下,添加1–1.9μM BRCA2[BRC1–8]链交换反应显著延迟了RAD51在dsDNA上的组装(A类,车道5-16)。通过1.3μM BRCA2在dsDNA上延迟RAD51组装[BRC1–8]15-60分钟(A类,9–12车道)伴随着jm形成的刺激(B类,车道6–10)。(B类)与切除的dsDNA底物共纯化DNA物种(图S1B类)标记为“ns”,车道之间的相对强度不变,表明它不会干扰反应。底部面板比较了有无BRCA2时jm产品的形成[BRC1–8]以切除的dsDNA底物的百分比表示,ns带的强度以任意单位表示。(C类)显示了对绞合交换反应进行的扩展时间过程分析,如B类,BRCA2在场[BRC1–8]. (D类)显示中数据的jm格式的量化B类C类误差条表示SEM。
图6。
图6。
BRCA2的反作用[BRC1–8]RAD51与ssDNA的结合与dsDNA的结合相互支持,以刺激链交换。BRCA2调节RAD51介导的HDR的假设模型[BRC1–8]如图所示。它是指DSB切除后产生3′-尾ssDNA底物的事件,但没有显示BRCA2的C末端ssDNA-结合域在取代RPA和引导RAD51到达ssDNA/dsDNA连接附近的底物方面的假定作用(9)。当BRCA2[BRC1–8]则ssDNA和dsDNA竞争RAD51结合。链交换效率低下,因为在dsDNA上过早、稳定的RAD51组装是徒劳的。巴西航空公司2【BRC1–8】有利于RAD51优先组装到ssDNA上,因为它促进RAD51-ssDNA结合同时抑制RAD51-dsDNA结合(右侧)。这些相反的效应相互加强,引导从突触前到链交换的突触步骤的逐步进展。

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