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.2009年8月14日；284(33):22048-22058.
doi:10.1074/jbc。M109.002758。 Epub 2009年6月3日。

肿瘤抑制因子密度增强磷酸酶-1（DEP-1）通过ERK1/2激酶的直接去磷酸化抑制RAS通路

弗朗西丝卡·萨科 1, 米歇尔·廷蒂 1, 安妮塔·帕尔玛 1, 伊曼纽拉·法拉利 1, Aurelio P Nardozza公司 1, Rob Hooft van Huijsduijnen先生 2, Takamune Takahashi高桥 三, 路易莎·卡斯塔尼奥利 1, 吉安尼·塞萨里尼 4
附属公司

肿瘤抑制因子密度增强磷酸酶-1（DEP-1）通过ERK1/2激酶的直接去磷酸化抑制RAS通路

弗朗西丝卡·萨科等。 生物化学杂志. .

摘要

密度增强磷酸酶-1（DEP-1）是一种跨膜受体蛋白酪氨酸磷酸酶，在肿瘤抑制中发挥着公认的重要作用。然而，由于其主要生理底物尚未牢固确立，其功能背后的机制细节尚不清楚。为了阐明这种磷酸酶抗增殖作用的机制，我们开始通过一种基于筛选高密度肽阵列的新方法来识别新的DEP-1底物。阵列实验的结果与生物信息学过滤器相结合，在MAPK通路中注释的蛋白质中识别8个潜在的DEP-1靶点。在本研究中，我们表明这些潜在靶点之一ERK1/2确实是体内直接的DEP-1底物。下拉和体外去磷酸化试验证实了我们的预测，并证明了DEP-1在靶向ERK1/2的磷酸化酪氨酸204方面的总体特异性。表皮生长因子刺激后，ERK1/2激活环的磷酸化可通过改变DEP-1的浓度进行调节，而不影响上游激酶MEK的活性。此外，我们发现DEP-1包含一个KIM样的基序，通过ERK1/2中常见对接域介导的对接机制招募ERK1/2蛋白。在保守对接域突变的ERK蛋白对DEP-1去磷酸化不敏感。总的来说，这项研究为这种磷酸酶的抗增殖作用提供了新的见解，并提出了一种可能也与密度依赖性生长抑制调节相关的新机制。

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图1。
图1。
识别MAPK途径中潜在候选DEP-1底物的策略。用6400个酪氨酸磷酸化肽文库攻击DEP-1催化结构域的捕获突变体D1205A。ERK1/2激活环中包含磷酸化（Tyr-204）13-mer的三个重复序列的芯片区域(圆圈斑点在里面黄色的)放大以证明实验再现性。
图2。
图2。
DEP-1特异性结合ERK1/2蛋白并使其去磷酸化。 A类将几个酪氨酸磷酸酶捕获突变体的GST融合蛋白与用EGF诱导的HeLa细胞蛋白提取物孵育5分钟。用SDS-PAGE分离亲和纯化的磷酸酶配体并转移到纤维素膜上。用抗磷酸酪氨酸抗体显示印迹(白细胞：α-4G10). 细胞裂解物(输入)和用GST蛋白纯化的样品亲和力(消费税)用作对照。抗ERK1/2显示相同的样品(WB：α-ERK1/2)和抗磷酸-ERK1/2(WB：α-ERK1/2(对))抗体。B类，HeLa细胞饥饿并用EGF处理5分钟。细胞裂解后，蛋白提取物与GST孵育，并与GST融合到野生型(重量)DEP-1催化结构域(DEP-1重量)或催化袋中携带D1205A突变的突变变异体(DEP-1承兑交单). 相互作用蛋白通过谷胱甘肽-甘露糖珠亲和纯化，通过SDS-PAGE分离，并通过抗磷酸酪氨酸（α-4G10型)，抗ERK1/2（α-ERK1/2号机组)和抗磷酸化ERK1/2（α-ERK1/2号机组(对))识别磷酸化Tyr-204的抗体。C类，饥饿后(0分钟)HeLa细胞与EGF孵育5、10和30分钟。蛋白质提取物通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜上。用抗磷Tyr-204-ERK1/2培养印迹(WB：α-ERK1/2(对))和抗ERK1/2(WB：α-ERK1/2)抗体。通过用抗微管蛋白重新保护来评估凝胶负载量(WB：α-微管蛋白).D类，将蛋白质提取物与表达为GST融合物的DEP-1捕获突变体一起孵育(DEP-1承兑交单). 用SDS-PAGE分析亲和纯化蛋白，并用抗磷酸-ERK1/2显示(WB：α-ERK1/2(对))和抗ERK1/2(WB：α-ERK1/2).
图3。
图3。
DEP-1直接脱磷酸ERK1/2在体外. A类、DEP-1和PTPβ野生型催化结构域与第页-检测缓冲液中的硝基苯磷酸盐底物。绘制了405时吸光度的增加，并根据直线斜率和比朗伯定律计算了两种PTP的比活度。B类HEK293细胞瞬时共转染5μg表达质粒的DNA，该表达质粒指导合成SRC激酶的Y527F组成活性突变体，并与HA-ERK1/2的第二个表达质粒共转染。细胞裂解后，用抗HA抗体对蛋白质提取物进行免疫沉淀。用裂解缓冲液清洗珠子，并用1m处理（+）或（-）米过碘酸钠(光伏)抑制磷酸酶活性。抗HA免疫沉淀(IP（IP）)在37°C的分析缓冲液中与1μg GST、GST-DEP-1野生型和GST-PTPβ野生型孵育指定时间。用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫印迹法分析ERK2的酪氨酸磷酸化水平（α-4G10）)和抗HA抗体（α-哈).C类，磷酸化ERK1/2信号的相对定量与绘制总ERK1/2并表示为条形图.
图4。
图4。
DEP-1直接脱磷酸ERK1/2体内.用全长野生型瞬时转染HEK293细胞(重量)DEP-1或其催化突变体(承兑交单;客户服务中心; Δ塞浦路斯). 转染的培养物与EGF孵育，在0时和5分钟后取样。细胞裂解后，用SDS-PAGE分析整个蛋白提取物，并用抗磷酸酪氨酸抗体进行Western blotting检测(白细胞：α-4G10). 通过显示抗体DEP-1（α-环境保护部-1)和抗管蛋白（α-微管蛋白). 通过抗磷酸化ERK1/2（α-ERK1/2号机组(对))和抗ERK1/2（α-ERK1/2号机组)抗体。用抗磷酸MEK（α-甲乙酮(对))和抗MEK（α-甲乙酮)抗体。
图5。
图5。
DEP-1对SRC活化细胞系中ERK1/2进行去磷酸化。 A类，HEK293细胞与全长HA-DEP-1或其非活性突变体瞬时共转染(承兑交单或客户服务中心)和5μg Y527F SRC激酶（组成性激活）表达质粒。用抗4G10抗体（α-4G10型). 用抗DEP-1和抗SRC（α-环境保护部-1; α-SRC公司)抗体。用抗微管蛋白抗体（α-微管蛋白). 用抗磷酸化ERK1/2（α-ERK1/2号机组(对))和抗ERK1/2（α-ERK1/2号机组)抗体。B类将5μg Y527F SRC激酶与编码全长野生型的表达质粒瞬时共转染HEK293细胞(重量)TC-PTP。用抗磷酸酪氨酸抗体（WB:α-4G10）免疫印迹分析全细胞裂解物的酪氨酸磷酸化谱。SRC和TC-PTP的转染效率通过显示具有相应抗体的裂解物进行验证(WB：α-SRC; α-TC-PTP公司). 用抗管蛋白评估凝胶载量相等(WB：α-微管蛋白). 用抗磷酸化ERK1/2（α-ERK1/2号机组(对))和抗ERK1/2（α-ERK1/2号机组)抗体。
图6。
图6。
DEP-1的耗竭增加了ERK1/2的激活。用两种不同的靶向DEP-1转录物的shRNA质粒瞬时转染HeLa细胞(车道1和2）或加扰shRNA(S公司)作为阴性对照。与EGF孵育后，用抗4G10抗体（α-4G10型). 用抗DEP-1和抗管蛋白抗体（α-环境保护部-1; α-微管蛋白). 通过抗磷酸化Tyr-204-ERK1/2（α-ERK1/2号机组(对))和抗ERK1/2（α-ERK1/2号机组)抗体。用抗磷酸-MEK（α-甲乙酮(对))和抗MEK（α-甲乙酮)抗体。
图7。
图7。
DEP-1在哺乳动物细胞中与ERK1/2相互作用。 A类用全长DEP-1磷酸酶或其催化突变体瞬时转染HEK293细胞(承兑交单;客户服务中心)并用EGF刺激5分钟。在0和5分钟时对等分样品进行取样，在细胞裂解后，用抗HA抗体免疫沉淀整个蛋白提取物。用裂解缓冲液清洗珠子，免疫沉淀(IP（IP）)被发现患有抗HA(白细胞：α-HA)，抗磷-ERK1/2(WB：α-ERK1/2(对))，抗ERK1/2(WB：α-ERK1/2)和抗GRB2抗体。B类，瞬时转染全长DEP-1野生型的HeLa细胞裂解物(重量)且未转染(NT公司)用EGF诱导5min，用抗DEP-1抗体免疫沉淀。免疫沉淀(IP（IP）)发现有抗DEP-1抗体(白细胞：α-DEP-1)，抗磷ERK1/2(WB：α-ERK1/2(对))和抗ERK1/2(WB：α-ERK1/2).
图8。
图8。
DEP-1通过结合其CD与ERK1/2形成复合物。 A类用全长DEP-1磷酸酶或其催化突变体D/A瞬时转染HEK293细胞，并用EGF刺激5分钟。细胞溶解后，用抗-HA免疫印迹法检测转染情况(白细胞：α-HA)，防FLAG(WB:α-标记)和抗管蛋白(WB：α-管蛋白)抗体。NT公司，未转染。B类用抗FLAG抗体免疫沉淀全蛋白提取物，纯化野生型(重量)或ERK2的Asp-319突变体，用抗HA抗体恢复DEP-1磷酸酶。用裂解缓冲液清洗珠子，免疫沉淀(IP（IP）)被反FLAG发现(WB:α-标记)，抗HA(白细胞：α-HA)，抗磷ERK1/2(WB：α-ERK1/2(对))和抗DEP-1(白细胞：α-DEP-1).
图9。
图9。
DEP-1 KIM-like基序中的K1016A替换强烈损害ERK1/2的募集。 A类，ERK1/2 KIM域对齐。这些位点共享一个N端疏水残基（ØH（H）)，一个或两个带正电荷的残留物(基本的)和ØAX（X）ØB图案。我们在DEP-1磷酸酶中鉴定出类似序列（修改自参考文献27）。B类瞬时转染全长K1016A DEP-1突变体和野生型(重量)磷酸酶。EGF诱导5分钟后，对细胞进行裂解，并用抗DEP-1和抗管蛋白抗体进行免疫印迹检测转染效率。通过用抗磷酸化ERK1/2探针检测蛋白提取物来监测ERK和p38 MAPK的磷酸化水平(WB：α-ERK1/2(对))，抗ERK1/2(WB：α-ERK1/2)，抗磷p38(白细胞：α-p38(对))和抗p38(白细胞：α-p38)抗体。NT公司，未转染。C类用抗HA抗体免疫沉淀全蛋白提取物，回收DEP-1蛋白。免疫沉淀样品(IP（IP）)用抗HA探针探测(白细胞：α-HA)，抗磷-ERK1/2(WB：α-ERK1/2（P） ），抗ERK1/2(WB：α-ERK1/2)和抗p38(白细胞：α-p38).D类用全长野生型磷酸酶或其突变体K1016A和3μg绿色荧光蛋白表达质粒瞬时共转染HEK293细胞。固定后，用抗DEP-1抗体对细胞进行染色，并用间接免疫荧光显微镜进行分析。
图10。
图10。
ERK1/2和DEP-1磷酸酶直接相互作用介导的生长接触抑制。根据图示模型，DEP-1具有两种抗增殖活性。通过与非活性ERK1/2结合，它将其隔离，并通过整合素和生长因子限制其激活。此外，它可以通过直接去磷酸化来关闭ERK活性。细胞融合增加了DEP-1的表达，而DEP-1反过来又通过灭活ERK1/2来抑制细胞增殖。
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