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.2009年7月29日；422（1）：171-80。
doi:10.1042/BJ20090471。

Cul3介导的Nrf2泛素化和抗氧化反应元件（ARE）激活依赖于Keap1 151位的部分摩尔体积

艾美·L·艾格勒 1, 埃文·斯莫尔, 马克·汉宁克, 安德鲁·梅塞卡
附属公司

Cul3介导的Nrf2泛素化和抗氧化反应元件（ARE）激活依赖于Keap1第151位的偏摩尔体积

艾美·L·艾格勒等。 生物化学杂志. .

摘要

Nrf2（核因子-红细胞2相关因子2）是一种转录因子，通过与ARE（抗氧化反应元件）结合来激活细胞保护基因的转录。Nrf2被富含半胱氨酸的Keap1蛋白（kelch-like ECH-associated protein 1）抑制，该蛋白以Nrf2为靶点，通过Cul3（cullin 3）介导的泛素化复合物进行泛素化和随后的降解。我们发现，人类Keap1的Cys（151）通过突变为色氨酸而被修饰，可以减轻Keap1对其的抑制，并允许Nrf2激活ARE。Keap1 C151W替代物对Cul3的亲和力降低，不能再用于靶向Nrf2进行泛素化，尽管它保留了对Nrf2的亲和力。构建了一系列12个突变Keap1蛋白，每个蛋白在151位含有不同的残基，以探索这种效应所需的化学物质。该系列揭示了Keap1丧失靶向Nrf2降解能力的程度，以及抑制ARE活化的能力，与残留物的偏摩尔体积密切相关。其他物理化学性质似乎对这种效果没有显著贡献。基于这一发现，提出了一个结构模型，其中151位的大残基引起空间冲突，从而导致Keap1-Cul3相互作用的改变。该模型对修饰Cys（151）的亲电试剂如何破坏Keap1的抑制功能具有重要意义。

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数字

图1
图1。萝卜硫烷、CDDO-Im和15d-PGJ2激活ARE对Keap1 C151的依赖性
(A类)面板B中使用的ARE感应器的结构，如Keap1 C151的共轭物所示。环戊烯酮环内15d-PGJ2内环β-位置硫醇加成的区域选择性已经确定，并在其他地方进行了综述[48]。CDDO-Im中的两个Michael受体位置都被证明有助于ARE激活[61]。为了简单起见，只显示了一个共轭，另一个迈克尔受体位点用星号标记。(B类)用Nrf2表达载体（野生型Keap1或Keap1 C151S）和含有ARE依赖性萤火虫荧光素酶报告基因的质粒转染MDA-MB-231细胞。包括含有组成性表达的Renilla荧光素酶的质粒，以使质粒水平正常化。在分析细胞裂解液中萤火虫和Renilla荧光素酶活性之前，将转染细胞暴露于DMSO（载体）、5μM萝卜硫烷、50 nM CDDO-Im或25μM 15d-PGJ2中16 h。y轴是firefly值与Renilla值的比值，所有数据都使用DMSO标准化为wt Keap1。
图2
图2。C151W突变对Keap1抑制ARE激活能力的影响以及萝卜硫烷的影响
(A类)Cys、Ser和Trp的结构，如C151位置的侧链所示。(B类)瞬时转染报告基因检测基本上如图1所示。细胞暴露于二甲基亚砜或萝卜硫烷16小时。为了与Keap1 C151W蛋白的are活性进行比较，这里以不同的比例显示的wt Keap1和Keap1 C1 51S的数据与图1中的数据相同。
图3
图3。Keap1 C151W对Nrf2水平和泛素化的影响，以及Keap1与Cul3和Nrf2的相互作用
(A类)用Nrf2和野生型Keap1、Keap1 C151W或Keap1 C288S的表达载体转染MDA-MB-231细胞。用抗Nrf2抗体进行免疫印迹分析每个细胞裂解物的当量（顶面板）。剥离印迹，并用抗Keap1抗体（中间面板）和抗微管蛋白抗体（底部面板）进行重复。(B类)用Keap1、HA-ubiquitin、Cul3和Gal4-Neh2表达载体转染MDA-MB-231细胞。细胞在裂解前用10μM MG132处理3小时。用抗Gal4抗体进行免疫沉淀，然后用抗HA抗体进行免疫印迹分析，以检测泛素化形式的Gal4-Neh2。(C类)用HA-Cul3和wt、C151W或C151S Keap1-CBD表达载体转染MDA-MB-231细胞。在上两个面板中，使用抗HA抗体进行免疫印迹分析，然后使用抗Keap1抗体剥离和重制印迹（下面板）。在底部两个面板中，使用甲壳素珠对相同的裂解产物进行亲和纯化。用抗HA抗体对洗涤后仍与珠子结合的蛋白质进行免疫印迹分析（顶面板），并用抗Keap1抗体对印迹进行剥离和重制（底面板）。(D类)实验按照面板C的描述进行，除了转染HA-Nrf2的表达载体而不是HA-Cul3的表达载体，并且用MG132处理细胞4.5小时。
图4
图4。Keap1 C151X存在下Nrf2激活ARE
(A类)瞬时转染报告基因测定基本上如图1所述进行。(B类)根据Keap1第151位每个残基的PMV绘制面板A的数据，如文中所述，该PMV是在310K下计算得出的。每个数据点都标有相应的残差缩写。
图5
图5。增加PMV的Keap1 C151突变体催化Nrf2泛素化
(A类)Cys、Asp、His、Tyr和Trp的结构，如C151位置处的侧链所示。(B类)瞬时转染报告基因检测基本上如图1所示。(C类)Gal4-Neh2泛素化分析基本上如图3B所示。
图6
图6。假定Keap1 BTB-Cul3相互作用界面模型立体图和Keap1残基151的位置
Keap1的一部分建模BTB域显示为带状图，一部分建模Cul3结构显示为曲面表示。BTB结构域中的Keap1残基151以透明表面表示和棒状表示显示，建模为半胱氨酸（深灰色的硫原子）和色氨酸（所有浅灰色的原子）。赖氨酸131显示在空间填充表示中。假定Cul3结合区中的Keap1残基125–127和162–164显示为深灰色的所有原子。
图7
图7。用反应性C151残基保存Keap1蛋白中的关键残基
使用clustalw 3.5c对六种脊椎动物Keap1蛋白的序列进行了比对。如果所有六种蛋白质都相同，则残留物以深灰色突出显示；如果化学上保守或物种间相同，则以浅灰色突出显示。使用BOXSHADE 3.3.1绘制保护图。路线中使用的GenBank登录号分别为3894323、16924016、1280415、51870493、164698434、56118572和109639157。所示编号对应于人类Keap1。斑马鱼Keap1a中对应于人类Keap1中C151的半胱氨酸没有反应，这是由于相邻的苏氨酸而不是赖氨酸[54]。标记的残基是图6中模型中突出显示的残基，它们在Keap1蛋白中都以反应性C151保守。
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