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.2009年7月4日；8(7):865-72.
doi:10.1016/j.dnarep.2009.04.001。 Epub 2009年5月14日。

人HMGB1直接促进三重定向补骨脂素链间交联上核苷酸切除修复蛋白之间的相互作用

萨宾·S·兰格 1, 马达瓦·C·雷迪, 凯伦·巴斯克斯
附属公司

人HMGB1直接促进三重定向补骨脂素链间交联上核苷酸切除修复蛋白之间的相互作用

萨宾·S·兰格等。 DNA修复（Amst）. .

摘要

补骨脂素是一种化学治疗剂，通过产生DNA链间交联（ICL）发挥作用，ICL具有特别的细胞毒性和诱变性，因为其复杂的化学性质使其难以修复。来自多种修复途径的蛋白质，包括核苷酸切除修复（NER），参与了哺乳动物细胞中它们的去除，但它们修复的确切性质尚不清楚。我们之前已经证明，HMGB1是一种参与染色质结构、转录调控和炎症的蛋白质，可以与具有RPA的三重定向补骨脂素ICL协同结合，并且缺乏HMGB1的哺乳动物细胞对补骨脂蛋白ICL过敏。然而，这种效应是否由HMGB1在DNA损伤识别中的作用介导尚不清楚。考虑到HMGB1与受损DNA结合的能力及其与RPA蛋白的相互作用，我们假设HMGB1和NER损伤识别蛋白一起作用，以帮助去除ICL。我们在这里表明HMGB1能够与三重定向补骨脂素ICL结合，并具有专用的NER损伤识别复合物XPC-RAD23B和XPA-RPA，并且在这些损伤上形成高阶复合物。此外，我们证明HMGB1在没有DNA的情况下与XPC-RAD23B和XPA相互作用。这些发现直接证明了HMGB1和NER损伤识别蛋白之间的相互作用，并表明HMGB1可能通过增强NER损伤认识因子之间的相互关系来影响ICL修复。

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数字

图1
图1。人HMGB1和XPC-RAD23B蛋白在三重定向补骨脂素ICL上的相互作用
人纯化重组HMGB1和XPC-RAD23B蛋白（~1×10−8M） 与~1×10孵育−8M放射性标记的三重定向补骨脂素ICL在30°C的结合缓冲液中放置20分钟。将抗体添加到指示的样品中，再继续孵育20分钟。蛋白质-DNA复合物在6%天然PAGE凝胶上经受EMSA，并通过放射自显影术进行可视化。通道1包含未受损的双链DNA，其余通道包含三重定向补骨脂素ICL（Tdp-ICL底物）。
图2
图2。人纯化重组HMGB1、XPC-RAD23B和RPA蛋白在三重定向补骨脂素ICL上的结合
人纯化重组HMGB1、XPC-RAD23B和RPA蛋白（~1×10−8M） 与~1×10一起孵育−8M放射性标记的三重定向补骨脂素ICL在30°C的结合缓冲液中放置20分钟。将抗体添加到指示的样品中，并继续孵育20分钟。蛋白质-DNA复合物在6%天然PAGE凝胶上进行EMSA，并通过放射自显影术进行可视化。通道1包含未受损的双链DNA，其余通道包含三重定向补骨脂素ICL（Tdp-ICL底物）。
图3
图3。蛋白质-DNA复合物中蛋白质的鉴定
(A类)人纯化的重组HMGB1、XPC-RAD23B和RPA蛋白（~1×10−8M） 与~1×10孵育−8M放射性标记的三重定向补骨脂素ICL（1、3和5道），或在30°C的结合缓冲液中缺乏DNA（2、4和6道）的情况下保持20分钟。蛋白质-DNA复合物在6%天然PAGE凝胶上进行EMSA，并通过放射自显影进行可视化，然后进行半干印迹，将蛋白质-DNA复合体转移到膜上。然后用α-RPA-70抗体印迹膜；(B、 C类)将人纯化重组HMGB1（第1道）、XPC-RAD23B（第2道）和RPA（第3道）分别或一起（第4道）在30°C的三向补骨脂素ICL底物上培养20分钟，然后使用6%的天然PAGE凝胶进行EMSA分析（B）切除对应于蛋白-DNA复合物的电泳带，进行SDS-PAGE，并用XPC、RPA和HMGB1抗体进行免疫印迹（C）.
图4
图4。将人纯化的重组HMGB1、XPC-RAD23B和RPA依次添加到三重定向补骨脂素ICL中
（A）纯化的重组人HMGB1（10 nM）在30°C下与放射性标记的三重定向补骨脂素ICL孵育20分钟，然后添加浓度增加的XPC-RAD23B和RPA蛋白（10、20或30 nM），再孵育30分钟，然后使用6%的天然PAGE进行EMSA分析。（B）重组人XPC-RAD23B和RPA蛋白（10 nM）与放射性标记的含ICL底物（Tdp-ICL底物）孵育20分钟，然后与HMGB1（10、20或30 nM）的浓度增加孵育20min，然后使用EMSA进行分析。
图5
图5。HMGB1与NER DNA损伤识别因子的相互作用
(A、 B类)钙调素树脂与CBP标记的HMGB1蛋白结合，然后与细胞提取物孵育(A类)或人类纯化XPC、HMGB1和RPA蛋白(B类)结合蛋白通过SDS-PAGE电泳，转移到膜上并用HMGB1或XPC抗体进行免疫印迹。钙调素树脂（CaM树脂）单独用作特异性对照，细胞提取物（cell Ext，A类)或纯化蛋白（Prot Mark，B类)作为蛋白质大小的标记物在凝胶上运行。(C、 D类)淀粉树脂与MBP标记的XPC-RAD23B蛋白结合(C类)或XPA蛋白(D类)然后用细胞提取物培养(C类)或人类纯化HMGB1和RPA蛋白(D类)，然后像A.MBP肽一样进行免疫印迹(C类)或淀粉树脂（淀粉树脂，D类)单独用作特异性对照，细胞提取物（cell Ext，C类)或纯化蛋白（Prot Mark，D类)作为蛋白质大小标记在凝胶上进行。(E类)使用兔IgG（对照）和HMGB1抗体从细胞提取物中免疫沉淀的人类XPA和HMGBI蛋白的代表性免疫印迹。
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