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.2009;4（5）：e5492。
doi:10.1371/journal.pone.0005942。 Epub 2009年5月8日。

外胚层神经皮层1在翻译水平下调Nrf2

王晓军 1, 唐娜·D·张
附属公司

外胚层神经皮层1在翻译水平下调Nrf2

王晓军等。 公共科学图书馆一号. 2009.

摘要

转录因子Nrf2是细胞防御机制对抗环境侵害的主要调节因子。Nrf2介导的抗氧化反应是通过编码第二阶段解毒酶、外源性转运体和抗氧化剂的一组基因转录完成的。这些基因的协调表达在保护细胞免受有毒和致癌损伤以及维持细胞氧化还原平衡方面至关重要。Nrf2通路的激活主要由Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）控制，Keap1是一个分子开关，根据细胞内氧化还原条件打开或关闭Nrf2信号通路。在这里，我们报道了一种新的Nrf2抑制剂外胚层神经皮层1（ENC1）的发现，它是一种BTB-Kelch蛋白，与Keap1属于同一家族。ENC1的瞬时表达降低了Nrf2及其下游基因表达的稳态水平。尽管ENC1与Keap1间接相互作用，但ENC1介导的Nrf2下调与Keap2无关。ENC1对Nrf2的负作用不是由于Nrf2稳定性的改变，因为蛋白酶体或溶酶体抑制剂都没有任何作用。ENC1的过度表达并没有导致Nrf2 mRNA水平的改变，相反，它导致了Nrf2蛋白合成速率的降低。这些结果表明，ENC1通过抑制Nrf2蛋白翻译发挥Nrf2的负调控作用，这又增加了控制Nrf2信号通路的复杂性。

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数字

图1
图1。ENC1下调Nrf2。
A.用HA-Nrf2表达载体和ENC1-Myc、Keap1-CBD、GAN1-Myc或Sarcosin-Myc的空载体或质粒转染MDA-MB-231细胞。转染后48小时对转染细胞进行裂解，并用抗HA、抗Myc、抗CBD和抗管蛋白抗体对细胞裂解产物进行免疫印迹分析。B.将HA-Nrf2或HA-SMN基因表达载体与空载体或ENC1-Myc表达载体一起转染到MDA-MB-231细胞。收获细胞并进行免疫印迹分析。C.将ENC1-Myc表达载体转染到MDA-MB-231细胞中。在细胞裂解之前，细胞未经处理或用50µM tBHQ处理16小时。细胞裂解物进行免疫印迹分析（左侧面板）。Nrf2条带的强度通过ChemiDoc XRS凝胶文档系统和Bio-Rad的Quantity One软件（右侧面板）进行量化。D.用不同数量的ENC1-Myc表达载体以及HA-Nrf2表达载体转染MDA-MB-231细胞。用抗HA和抗Derlin-1抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。
图2
图2。ENC1在转录后水平下调Nrf2。
A.在细胞裂解之前，用7.5µM SF或50µM tBHQ处理转染有ARE驱动萤火虫荧光素酶、TK-尼罗荧光素酶质粒的MDA-MB-231细胞和指示基因16小时。测量萤火虫和肾萤光素酶的活性。从三个独立的实验中计算平均值和标准偏差。B.用抗Nrf2（左面板）、抗HA、抗Myc、抗CBD和抗β-肌动蛋白抗体（右面板）对小份裂解产物进行免疫印迹分析。C.将空质粒或ENC1-Myc或Keap1质粒转染到MDA-MB-231细胞中，用tBHQ处理细胞16小时。在转染后48小时，通过实时PCR测定Nrf2、NQO1、HO-1、ENC1和Keap1的相对mRNA水平。
图3
图3。ENC1介导的Nrf2下调与蛋白酶体或溶酶体降解无关。
A.用空载体或ENC1-Myc载体转染MDA-MB-231细胞。在转染后48小时裂解细胞之前，用蛋白酶体抑制剂MG132（M）（10µM）、clasto-lactacystinβ-内酯（Lac）（10μM）或环氧霉素（Ep）（1µM。用抗HA、抗Myc和抗β-肌动蛋白抗体对细胞裂解产物进行免疫印迹分析。用HA-Nrf2和空载体或ENC1-Myc转染B.MDA-MB-231细胞。如上所述，用蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理转基因细胞。进行免疫印迹分析。C、。体内在转染HA-Ub和Gal4-Neh2质粒以及ENC1-Myc或Keap1-CBD的MDA-MB-231细胞中进行泛素化分析。在细胞裂解之前，用10µM MG132处理转染细胞4小时。细胞裂解物通过加热变性，并用抗Gal4抗体进行免疫沉淀。用抗HA抗体对沉淀的蛋白复合物进行免疫印迹分析，以检测泛素结合的Gal4-Neh2（顶面板）。用所示抗体对小份的总细胞裂解物进行免疫印迹（底部三个面板）。
图4
图4。Keap1在ENC1介导的Nrf2下调中不是必需的。
A.MDA-MB-231细胞转染ENC1-Myc表达载体，以及空载体或Keap1-CBD表达载体。细胞裂解物进行甲壳素下拉试验。沉淀蛋白用抗Myc和抗CBD抗体进行免疫印迹分析，以检测Keap1-CBD和ENC1-Myc（顶面板）。用指示的抗体通过免疫印迹分析总裂解物的小等分试样（下图）。B.用抗Keap1抗体免疫沉淀MDA-MB-231细胞裂解物。用抗Nrf2和抗ENC1抗体对沉淀的蛋白复合物进行免疫印迹分析。IgG作为阴性对照纳入免疫沉淀分析。C.全长ENC1（E-FL）质粒和两个ENC1缺失突变体E320和E570、Nrf2和荧光素酶（Luc）用于在体外转录/翻译合成[35S] -标记蛋白质。蛋白质与纯化自大肠杆菌用镍珠拉下含有Keap1的蛋白质复合物，并在SDS-PAGE中解析，并通过放射自显影法检测。Nrf2和荧光素酶分别作为阳性和阴性对照。20%[35S] -标记的蛋白质通过SDS-PAGE凝胶进行解析，以显示每个蛋白质的等效输入（右侧面板）。D.Keap1-/-和野生型MEF细胞用HA-Nrf2和ENC1-Myc的质粒转染。转染后48小时对细胞进行裂解。用抗HA、抗Myc和抗β-肌动蛋白免疫印迹法分析细胞裂解产物。E.将转染Keap1-CBD、HA-Nrf2和ENC1-Myc质粒的MDA-MB-231细胞的细胞裂解物用于甲壳素珠的下拉分析。沉淀蛋白用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析（左图，顶部两个面板）。用所示抗体（左图，底部四个面板）通过免疫印迹分析小份总裂解物。使用Quantity One（BIO-RAD）量化Nrf2和β-肌动蛋白带强度。Nrf2的强度被归一化为β-肌动蛋白的强度（右图）。
图5
图5。ENC1在翻译水平下调Nrf2。
A.用空载体或ENC1-Myc表达载体转染MDA-MB-231细胞进行脉冲相分析。细胞在含有[35S] -蛋氨酸和[35S] -半胱氨酸标记蛋白质。然后在细胞溶解之前，将细胞清洗并在正常的完全培养基中培养指定的时间段。用抗Nrf2抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，免疫沉淀在SDS-PAGE凝胶中溶解并通过放射自显影术检测。B.使用数量一（BIO-RAD）量化Nrf2带强度，绘制并计算半衰期。C.脉冲相分析以相同的方式进行，但细胞用100µM tBHQ处理4小时。图5C中的量化数据。
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