跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2009年5月19日；106(20):8338-43.
doi:10.1073/pnas.0811349106。 Epub 2009年5月4日。

肿瘤抑制因子WTX穿梭至细胞核并调节WT1活性

米格尔·N·里维拉 1, Woo Jae Kim（吴在金）, 朱莉·威尔斯, 阿曼达·斯通, Alexa汉堡, 埃里克·J·科夫曼, 张建民, 丹尼尔·哈伯
附属公司

肿瘤抑制因子WTX穿梭至细胞核并调节WT1活性

米格尔·N·里维拉等。 美国国家科学院程序. .

摘要

WTX编码一个在Wilms肿瘤中失活的肿瘤抑制基因，最近通过增强细胞质β-连环蛋白（CTNNB1）降解参与WNT信号传导。在这里，我们报告了WTX易位到细胞核，这是一种由内源性剪接变异体修饰并由核输出抑制剂调节的属性。WTX存在于不同的亚核结构中，并与副啄标记p54NRB/NONO共定位，表明其在转录调控中发挥作用。值得注意的是，WTX与编码锌指转录因子的另一种Wilms肿瘤抑制因子和干细胞标记物WT1结合，并增强WT1介导的内源性靶基因Amphiregulin的转录。总之，这些观察结果表明，WTX在核途径中的作用与细胞分化程序的转录调控有关。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
WTX的N端通过选择性剪接进行修改。(A类)WTX-重量产生2种可通过N末端的RT-PCR检测到的RNA产物（核苷酸1–1380）。HEK-293细胞转染后，出现预期的1380-bp产物，大约550 bp处有一个额外的带。(B)WTX（WTX-WT和WTX-S）的不同亚型示意图以及通过自动数据库注释（WTX-PRED）预测的ORF。APC结合域显示为红框（氨基酸280–368、380–431和717–834）。N端PtdIns（4,5）P2还显示了结合区域（氨基酸2–209）、酸性区域（DE，370–411）和富含脯氨酸区域（P，952–1104）。未片段化WTX-WT（1135 aa）和WTX-S（858 aa）的转录本由1个非编码外显子和1个编码外显基因组成。WTX-S是由一个内部剪接事件产生的，该事件去除了50-326个氨基酸。WTX-PRED（804 aa，括号内）的转录本预计来自一个较短的第二外显子（785 aa）和另一个尚未得到内源性证实的第三外显子。箭头表示用于检测选择性剪接的引物的位置。星号标记了内源性检测到的2个转录本。(C类)WTX-S公司存在于人类肾脏、大脑和脾脏中，占内源性转录物的20%。的N末端的RT-PCRWTX公司对选定的胎儿（F）和成人（A）人体组织以及使用不同比例的重量-重量和WTX-S公司质粒。内源性的最高相对水平WTX公司（成人肾脏）类似于含有20%剪接质粒的混合物。(D类)WTX-重量产生2条蛋白带（190kDa和150kDa），其对应于WTX公司.转染HEK-293细胞后，WTX-S公司（缺少通过剪接去除的核苷酸）产生与下面的带相对应的蛋白质WTX-重量WTX-NS（保持相同的氨基酸序列，但由于单个核苷酸的改变而缺少剪接供体位点）产生与由WTX-重量.
图2。
图2。
WTX定位于质膜、细胞质和细胞核。使用慢病毒产生表达多种WTX-GFP融合的可诱导U2OS细胞，诱导24小时后通过旋转圆盘共焦显微镜分析细胞。(A类)WTX-NS、WTX-S和WTX-WT具有不同的细胞内定位模式。WTX-NS存在于质膜和细胞质中。细胞间接触时质膜定位更明显。WTX-S定位于细胞质和细胞核，存在于不同的核内隔室中，具有“斑点”外观，也呈弥漫性。WTX-WT具有这两种亚型的特征。细胞核用DAPI染色。原始放大倍数，1000×。(B)抑制核输出后，在细胞核中可检测到WTX-NS。分析前10 h用2 ng/mL LMB处理细胞，以抑制CRM1介导的核输出。LMB处理后，在细胞核中很容易检测到WTX-NS，其模式与WTX-S和WTX-WT相似。原始放大倍数，400倍。(C类)WTX亚型核定位的量化。LMB治疗后，WTX-S、WTX-NS和WTX-WT的细胞核定位显著增加。误差条表示3个独立计数（每个100个细胞）的标准偏差。
图3。
图3。
WTX定位于特定的核内隔间。(A类)WTX与p54NRB共定位，但不与PML或SC35共定位。用WTX-WT-GFP融合构建物转染U2OS细胞，并用旋转圆盘共焦显微镜检测与亚核隔室标记物的共定位。观察到WTX-WT和p54NRB的精确共定位。原始放大倍数，1000×。(B)用放线菌素B处理后，细胞核WTX重新分布到核周帽。用放线霉素B（RNA合成抑制剂）处理WTX-WT-GFP诱导的U2OS细胞。2小时后，WTX主要存在于核周帽中，这是定位于副啄木鸟的蛋白质的共同特性。RNA染色，Pyronin-Y（红色），用于突出核仁。原始放大倍数，1000×。
图4。
图4。
WTX结合WT1，一种在Wilms肿瘤中失活的转录因子。(A类)WTX绑定WT1（-KTS）和WT1（+KTS）。用FLAG标记的WTX-WT和WT1（-KTS）或WT1（+KTS）转染HEK-293细胞。24小时后，对裂解产物进行免疫沉淀，并通过Western blotting进行分析。用抗WT1免疫沉淀后用抗FLAG抗体进行免疫印迹，检测WTX-WT表达的未切割和剪接亚型。WT1的两种主要亚型（-KTS和+KTS）分别进行测试，结果相同。用抗FLAG免疫沉淀后，WTX-WT1相互作用也很明显。U2OS细胞也获得了类似的结果(图S1). (B)纯化的WTX与细菌表达的WT1结合。通过免疫沉淀纯化U2OS细胞中表达的FLAG标记的WTX-WT，并在GST结合柱上测试其与细菌合成的GST或WT1-GST的结合。结合蛋白通过Western blotting进行分析。使用WT1-GST时检测到WTX-NS和WTX-S，但单独使用GST时未检测到。(C类)WTX-WT1交互映射到WTX的C终端。WTX缺失构建物与WT1共转染，并通过免疫沉淀和Western blotting检测其结合。图中显示了用于映射的不同WTX构造与WTX-WT的关系（标记为a–I，V是矢量控制）。片段A–D将WTX的C末端定义为相互作用的位点，因为氨基酸561–1135（D）存在强信号，而未检测到氨基酸1–561（B）的信号。使用结构体F到I进行精细映射。结构体F（WTX-PRED，缺少氨基酸786–1135）、G和H（用星号标记）的结合减少，而结构体I检测到显著的结合。因此，氨基酸786-952定义了WT1结合的关键区域。WTX域的标记如图1所示。
图5。
图5。
WTX调节WT1的转录活性。(A类)WTX与WT1协同作用以激活WT1响应启动子。使用荧光素酶报告质粒水飞蓟素启动子、WT1和WTX在HEK-293细胞中的联合转染产生的荧光素酶活性是单独转染WT1的3倍。降低WT1结合活性的WTX-PRED的作用减弱。pLenti4质粒用于蛋白质表达。转染24小时后测定荧光素酶活性。(B)WTX-NS介导WTX对WT1活性的影响。联合转染后，WTX NS与WT1荧光素酶活性协同作用于水飞蓟素发起人。WTX-S在本试验中几乎没有活性。(C类)WTX和WT1之间的协同作用可以通过测量内源性水飞蓟素成绩单。用表达WTX-WT的慢病毒感染WT1诱导的HEK-293细胞。24小时后诱导WT1，内源性水飞蓟素感染48 h后用定量PCR检测。仅WT1增加水飞蓟素水平为10倍，WTX本身没有显著影响。增加了50倍水飞蓟素当WT1和WTX同时上调时观察到。Western blot显示WTX和WT1蛋白水平。(D类)WTX下调降低内源性水飞蓟素HEK-293细胞被编码2种不同shRNAs的慢病毒感染。WTX和水飞蓟素感染后96 h用qPCR检测。内源性显著下降水飞蓟素用两种shRNAs观察到。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. 里维拉·明尼苏达（Rivera MN）、哈伯·达（Haber DA）。《威尔姆斯肿瘤：连接肾脏肿瘤发生和器官发育》。Nat Rev癌症。2005;5:699–712.-公共医学
    1. Call KM等。人类11号染色体Wilms肿瘤位点锌指多肽基因的分离和表征。细胞。1990;60:509–520.-公共医学
    1. Gessler M等人。77例肾母细胞瘤中WT1基因的罕见突变。哼，变种。1994;3:212–222.-公共医学
    1. Gessler M，Poustka A，Cavenee W，Neve RL，Orkin SH，Bruns GA。通过染色体跳跃鉴定的锌指基因在Wilms肿瘤中的纯合子缺失。自然。1990;343:774–778.-公共医学
    1. Koests R等。β-catenin原癌基因的突变激活是Wilms肿瘤发展中的常见事件。1999年癌症研究；59:3880–3882.-公共医学

出版物类型

LinkOut-更多资源