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.2009年5月10日;387(2):364-72.
doi:10.1016/j.virol.2009.03.002。 Epub 2009年3月26日。

两个乙型肝炎病毒基因组之间的嵌合构建证实了核心启动子突变的转录影响,并揭示了核心基因突变的多重效应

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两个乙型肝炎病毒基因组之间的嵌合构建证实了核心启动子突变的转录影响,并揭示了核心基因突变的多重效应

蔡爱玲(Adrienne Tsai)等。 病毒学. .

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)克隆4B的复制效率远高于相同基因型的克隆2A。将其T1753C、A1762T、G1764A和C1766T核心启动子突变引入2A基因组大大增强了基因组复制并抑制了HBeAg表达。在这里,我们表明这些效应是由前基因组RNA的转录上调和前核心RNA的抑制介导的。嵌合结构分析表明,2A核心基因的5'端赋予了较高水平的前基因组RNA,但相对于4B序列,核心蛋白和基因组复制较少。分泌型病毒的基因组成熟度因2A基因组核心蛋白中的突变而降低,但因4B核心蛋白中发现的突变而提高。4B核心蛋白迁移速度快于克隆2A。各种表型和相关突变之间的可能联系仍有待确定。

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图1
图1
在2A和4B基因组之间构建嵌合体,并比较RNA转录、核心蛋白表达、基因组复制和病毒分泌。(A) 嵌合结构的示意图。2A和4B衍生序列分别显示为开盒和填充盒。(B) 两个基因组的RsrII–ApaI片段中的突变。显示了核苷酸水平、基本核心启动子(BCP)以及核心和P(pol)蛋白的序列变化。2A和4B基因组的变化分别列在每条线的上方和下方。(C) 转染后第4天收集的细胞中pc-RNA和pg-RNA的引物延伸分析。(D,E)使用来自Abcam(D)的小鼠单克隆抗体14E11或来自Dako(E)的兔多克隆抗体对第5天细胞裂解液的核心蛋白进行Western blot分析。用这两种抗体依次探测相同的印迹。显示核心蛋白的位置。用GAPDH抗体重新标记印迹显示出类似的蛋白质负载量(数据未显示)。(F) 转染后第5天DNA复制的Southern blot分析。显示3.2-kb、1.7-kb和1.5-kb大小的标记。RC:松弛圆形;DL:双绞线线性;SS:单股。(G) 转染后第5天收集的培养上清液中病毒相关DNA的Southern blot分析。用抗HBs多克隆抗体从培养上清液中免疫沉淀病毒。
图2
图2
核心启动子突变体中pg RNA、pc RNA转录和核心蛋白表达的比较。(A) 核心启动子1753、1762、1764和1766位的序列,突变以粗体显示。在之前的研究中,Chi11被称为Ex2(Parekh等人,2003)。(B) pg RNA和pc RNA引物延伸分析。(C)核心蛋白表达的Western blot分析。用GAPDH抗体探测相同的印迹,发现蛋白质负载量相似(数据未显示)。
图3
图3
乙型肝炎病毒基因组复制和4B核心间病毒粒子分泌的重组二聚体和CMV启动子驱动的2A、4B或6.2来源的核心蛋白结构。Huh7细胞与1μg 4B核共转染二聚体和0.2–1μg CMV核心结构(面板A–C),或0.5μg 4B核心二聚体和0.3–1.5μg CMV核心结构(面板D和E)。作为阳性对照,用1μg或0.5μg 4B二聚体转染细胞。(A,D)转染后第5天基因组复制的Southern blot分析。DL:双链线性DNA;SS:单链DNA。(B,E)转染后第5天病毒分泌的Southern blot分析。(C) 核心蛋白表达的IP-Western-blot分析。使用Dako抗体从细胞裂解液中免疫沉淀核心蛋白,并用Dako和Abcam抗体在Western blot中依次检测核心蛋白。指出了用于IP(Ig)和核心蛋白的抗体的位置。(F) 比较2A、4B和6.2基因组的EcoRI二聚体表达的核心蛋白的迁移率。
图4
图4
带有2A和4B衍生核心基因的构建物之间病毒粒子和裸核心粒子基因组成熟度的比较。通过CsCl梯度超速离心分离病毒和裸核颗粒,从顶部提取约11个组分。通过Southern blot分析组分3–10。RC:松弛圆形;DL:双绞线线性;SS:单股。每个部分的密度在底部提供。
图5
图5
通过热处理验证病毒相关的双链和单链DNA。用抗HBs抗体从培养上清液中免疫沉淀病毒,并将提取的DNA分成两等份。其中一部分在95°C下加热5分钟,然后在冰上冷却。DNA在1.5%琼脂糖凝胶中分离,然后进行Southern blot分析。DS:双绞线;SS:单股;RC:松弛圆形;DL:双绞线线性。
图6
图6
跨补体分析ε/第页和核心突变体。这个ε/第页突变体可以表达核心蛋白,而核心突变体表达P蛋白,其pg RNA可作为前基因组进行包被和转化为DNA。Huh7细胞与ε/第页突变体和核心以0.5μg/1.5μg、1μg/1μg或1.5μg/0.5μg的比例进行突变,并在5天后收获。作为阳性对照,细胞转染1μg克隆2A(第15道)或4B(第16道)以及1μg pcDNA3.1载体。17道:模拟转染细胞。(A) 核心颗粒内DNA复制的Southern blot分析。(B) 培养上清分泌病毒的Southern blot分析。(C) 使用Dako的多克隆抗体对细胞裂解液中的核心蛋白进行Western blot分析(上面板),并用GAPDH抗体对相同的blot进行复制(下面板)。

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