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.2009年4月24日；284(17):11039-47.
doi:10.1074/jbc。M808058200。 Epub 2009年3月5日。

c-Kit的D816V突变规避了c-Kit信号转导中对Src家族激酶的需求

孙建民 1, 马林·佩德森, 拉尔斯·伦斯特朗
附属公司

c-Kit的D816V突变规避了c-Kit信号转导中对Src家族激酶的需求

孙建民等。 生物化学杂志. .

摘要

受体酪氨酸激酶c-Kit在造血过程中起着关键作用，受体的功能获得性突变常见于多种恶性肿瘤，包括急性髓细胞白血病、胃肠道间质瘤和睾丸癌。这些疾病中最常见的c-Kit突变是将816位的天冬氨酸残基替换为缬氨酸（D816V），导致受体的组成性激活。在本研究中，我们旨在研究Src家族激酶在c-Kit/D816V信号传导中的作用。Src家族激酶对于野生型c-Kit的磷酸化以及下游信号通路（包括受体泛素化和Ras/Mek/Erk通路）的激活是必要的。我们的数据表明，与野生型c-Kit不同，c-Kit/D816V的磷酸化不依赖于Src家族激酶。此外，我们发现受体泛素化和c-Kit/D816V激活Erk均不需要激活Src家族激酶。使用合成肽进行的体外激酶分析表明，c-Kit/D816V具有与Src和Abl酪氨酸激酶类似的底物特异性改变。我们进一步证明，与野生型c-Kit相比，Src家族激酶对c-Kit/D816V细胞生存、增殖和集落形成是不可或缺的。综上所述，我们证明c-Kit/D816V介导的信号转导途径与野生型c-Kit激活的途径明显不同，并且c-Kit的底物特异性改变绕过了Src家族激酶在生长和生存信号传递中的需要，从而有助于c-Kit/D 816V的转化潜能。

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数字

图1。
图1。
野生型的表达和激活(重量)c-Kit和Ba/F3细胞中的c-Kit/D816V。 A类，表达野生型的Ba/F3细胞c-Kit、c-Kit/Y568F、c-Kit/D816V或c-Kit/D816V/Y568F用PE-结合抗c-Kit抗体或同型对照，然后检查流式细胞术检测受体细胞表面表达(开放式曲线,抗c-Kit；填充曲线，同种型对照）。B，的表达式基于流式细胞术和Western blotting对c-Kit进行定量。误差线表示标准偏差。C类，Ba/F3电池表达野生型c-Kit或c-Kit/D816V的人饥饿，SCF刺激（100ng/ml）并进行免疫沉淀(IP（IP）)使用c-Kit抗体。针对pTyr-568的磷孢子特异性抗体(第568页),pTY-703型(第703页)，pTyr-721(第721页)和pTyr-936(第936页)c-Kit用于检测个体酪氨酸残基。作为对照，磷酸酪氨酸(第页)和c-Kit评估表达水平。箭头指示c-Kit的130-kDa未成熟带和c-Kit中的145-kDa成熟带，分别是。国际银行，免疫印迹。
图2。
图2。
Cbl的本构激活和c-Kit在Ba/F3中的泛素化表达c-Kit/D816V的细胞。表达c-Kit/D816V的Ba/F3细胞饥饿和SCF刺激（100 ng/ml）。A类，裂解物受到免疫沉淀(IP（IP）)随后使用c-Kit抗体通过Western blot(国际银行)使用泛素抗体进行分析，磷酸酪氨酸(pY型)和c-Kit。重量，野生型。B,使用Cbl抗体对裂解产物进行免疫沉淀，然后使用抗磷酸酪氨酸和Cbl抗体进行蛋白质印迹分析。钡/F3以表达野生型c-Kit的细胞作为对照。
图3。
图3。
达沙替尼抑制c-Kit/D816V和增加受体的细胞表面表达。Ba/F3细胞表达野生型(重量)培养c-Kit或c-Kit/D816V突变株含或不含Dasatinib（2 n米)持续24小时。A类，个单元格饥饿并用SCF（100 ng/ml）刺激使用c-Kit抗体进行免疫沉淀。泛素化水平，酪氨酸通过Western blot分析磷酸化和c-Kit表达(国际银行).第页，磷酸酪氨酸。B，细胞染色与PE结合的抗c-Kit抗体或同型对照，然后流式细胞术检测表达。细胞表面表达水平c-Kit的表达水平Dasatinib孵育率为100%，并与其他细胞进行比较(灰色列：无孵化；黑色立柱：与孵育达萨提尼布）。所示数据是三个独立实验的平均值具有误差线定义标准偏差。
图4。
图4。
磷酸化和c-Kit/D816V的泛素化。表达野生型的Ba/F3细胞(重量)c-Kit、c-Kit/Y568F、c-Kit/D816V或c-Kit/D816V/Y568F为挨饿。A类之后，用Src抑制剂预培养细胞SU6656（2μ米)SCF刺激前30分钟（100 ng/ml）然后是免疫沉淀(IP（IP）)使用c-Kit抗体。之后SDS-PAGE和电转移，用泛素抗体检测膜并用磷酸酪氨酸重新处理(第页)和c-Kit抗体。国际银行免疫印迹；第568页，pTyr-568。B，个单元格与Src抑制剂SU6656（2μ米)持续30分钟SCF刺激（100 ng/ml）和免疫沉淀前使用Cbl抗体。在SDS-PAGE和电转移后，用磷酸酪氨酸和Cbl抗体显示Cbl的激活。
图5。
图5。
抑制Src家族激酶对Erk激活的影响不同在表达野生型的Ba/F3细胞中(重量)c-Kit和c-Kit/D816V。 A类，表达野生型c-Kit或c-Kit/D816V的Ba/F3细胞被饥饿然后用SCF（100 ng/ml）刺激。全细胞裂解物Western blot检测(国际银行)使用抗体进行分析磷标记(pErk公司)和磷酸化-Akt(pAkt公司). 过滤器用Erk2、Akt和β-肌动蛋白抗体进行重复试验，以验证等负荷。B、表达野生型c-Kit、c-Kit/Y568F、c-Kit/D816V的Ba/F3细胞，或c-Kit/D816V/Y568F饥饿，然后用Src预孵育抑制剂SU6656（2μ米)SCF刺激前30分钟（100纳克/毫升）。总细胞裂解物(TCL公司)被免疫印迹使用抗磷酸化Erk.Erk2和β-actin抗体进行分析用作加载控制。C类，量化在中获得的数据面板BBa/F3细胞表达Erk磷酸化水平野生型c-Kit设置为100。数据表示三份副本的平均值用误差线显示标准偏差。D类，细胞裂解物被免疫沉淀(IP（IP）)使用Shc抗体，并使用针对磷酸酪氨酸和Shc。第页，磷酸酪氨酸。
图6。
图6。
c-Kit/D816V获得Src活性。表达野生型的Ba/F3细胞(重量)或c-Kit/D816V饥饿，SCF刺激（100 ng/ml），随后使用c-Kit抗体进行免疫沉淀。这个免疫沉淀与Src optimal一起用于激酶分析肽作为底物。野生型c-Kit对底物的磷酸化富士FLA 3000检测到c-Kit/D816V，信号强度为由Multigage软件量化。误差线指示标准偏离。
图7。
图7。
c-Kit/D816V诱导的细胞中不需要Tyr-568的磷酸化甲基纤维素的存活、增殖和生长。Ba/F3电池表达野生型(重量)c-Kit、c-Kit/Y568F、c-Kit/D816V或清洗c-Kit/D816V/Y568F，然后在6孔板中播种100000个细胞/ml，含SCF（100 ng/ml，黑色立柱)或没有细胞因子(灰色列)作为对照，然后进行48小时的培养。A类细胞用annexin V-PE凋亡检测试剂盒染色然后进行流式细胞术检测活细胞、凋亡细胞和死亡细胞。误差线表明标准偏差。B，用台盼蓝计数活细胞排除。误差线表示标准偏差。C类，殖民地在甲基纤维素中形成。
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