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.2009年4月22日;28(8):1016-28.
doi:10.1038/emboj.2009.47。 Epub 2009年2月26日。

高尔基体顺侧的微管成核需要AKAP450和GM130

附属公司

高尔基体顺侧的微管成核需要AKAP450和GM130

萨布丽娜·里韦罗等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

我们报告称,高尔基体微管(MT)成核需要AKAP450,这是一种中心体γ-TuRC相互作用蛋白,也与高尔基体形成独特的网络。AKAP450的耗竭使MT在高尔基体上的核化消失,而顺高尔基体蛋白GM130的耗竭导致AKAP450网络的紊乱和MT核化的受损。Brefeldin-A处理诱导AKAP450重新定位到ER出口位置,并伴随MT成核能力重新分配到ER。AKAP450以MT依赖、GM130依赖的方式特异性结合高尔基体的顺侧。短期依赖AKAP450生长的MT被CLAP2覆盖。与中心体一样,动力蛋白/动力蛋白复合物是固定高尔基体生长的MT所必需的。我们进一步表明高尔基体相关AKAP450在细胞迁移中起作用,而不是在中心体高尔基体的细胞极化中。我们建议通过GM130在高尔基体膜上招募AKAP450,使中心体相关的成核活性延伸到高尔基体,以控制MT亚群的组装,确保高尔基体内的特定功能或将特定货物运输到细胞外围。

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数字

图1
图1
AKAP450存在于与GA接口相关联的网络中(一个)用A24抗体染色的RPE1细胞。(B类)用A24抗体WB分析RPE1细胞的NP-40可溶性(SF)和不溶性(IF)组分。(C类)用加扰或敲低siRNA(AKAP-1或AKAP-2)、表达短发夹的pSUPER(AKAP-1 shRNA)或慢病毒(AKAP-1 shRNA慢病毒)载体转染RPE1细胞。72小时后,制备总裂解液,并通过WB分析AKAP450或α-微管蛋白作为负荷控制。或者,用带有A24抗体的IF固定和处理细胞。D、 耗尽细胞;ND,未完成细胞。箭头表示中心体(CTR)。(D类——F类)通过共聚焦显微镜分析AKAP450(绿色)和GM130(D)、CTR433(E)或Golgin245(F)的双标记细胞。将显示合并的图像。箭头指向中心体。棒材,10μm。荧光强度曲线(底部)对应于图像D、E和F中绘制的线条(如图所示,第1、2和3行)。(G公司)基于皮尔逊相关系数,ICA对协同定位进行量化。这些值是在16个不同的单元格中随机位置绘制的10条线的平均值,每条线平均包含500个像素。误差条表示±标准误差。
图2
图2
在没有MT的情况下,AKAP450与膜的结合保持不变(一个)RPE1细胞在4°C下培养40分钟,并标记AKAP450(绿色)、微管蛋白(红色)和Golgin245(蓝色),或用NZ处理2小时(B类C类)AKAP450(绿色)、GM130(B,红色)或CTR433(C,红色)和Golgin245(蓝色)三重标签。B和C中的框在每个图像的右侧放大。右侧描绘了从相应放大框(1和2)中所示的线条中提取的荧光强度剖面。请注意,AKAP450和GM130在第1行中的位置几乎相同。(D类)紫杉醇处理的细胞三联标记AKAP450(绿色)、微管蛋白(红色)和GMAP210(蓝色)。(E类)AKAP450网络对BFA治疗敏感。显示AKAP450(绿色)与ERES关联的合并图像显示抗GMAP210(红色)和抗Sec31抗体(蓝色)。右侧显示了来自插入区域的每个通道的灰色图像。箭头指向中心体。棒材,10μm。(F类)使用A24抗体从所示的对照或处理细胞共免疫沉淀AKAP450、GCP2和γ-微管蛋白。α-微管蛋白印迹也显示为阴性对照。E、 总提取物;IP,免疫沉淀物。
图3
图3
MT在GA成核(一个B类)冷诱导解聚(A)和复温(B1,箭头)后形成的MT,与AKAP450(B2,箭头)共定位,GA标记为Golgin245(B3,合并图像)。(C类D类)冲洗后0(C)或5分钟(D)时,NZ处理的细胞被四重标记如下:用相同的次级抗鼠抗体显示单克隆抗栀子苷和抗管蛋白抗体,而抗兔和抗人抗体分别显示AKAP450和Golgin245。在D1中,显示了巨蛋白和微管蛋白标记。在C和D3中,giantin和tubulin为绿色,AKAP450为红色,Golgin245为蓝色。B1、B2、D1和D2为倒置图像。(E类)像D中处理过的细胞的高倍视图显示,生长中的MT的负端含有AKAP450。(F类)高尔基体小型四分体标记如D所示,表明MT从AKAP450所在的顺面生长。棒材,10μm。
图4
图4
在GA处MT成核需要AKAP450(一个——D类)对照组(A,C)或AKAP450缺失(B,D)冷处理细胞在复温1分钟后(A,B)或NZ处理细胞在冲洗5分钟后(C,D)标记AKAP450(红色)、微管蛋白(绿色)和GMAP210(蓝色)。A1–D1是微管蛋白染色的倒置图像。A2–D2为合并图像。E类F类显示在室温下5分钟后,AKAP450未完成(E)或AKAP450完成(F)冷处理细胞的AKAP450标记为红色,微管蛋白标记为绿色,GMAP210标记为蓝色。E1和F1是微管蛋白染色的倒置图像。合并的图像如E2和F2所示。箭头表示中心体。棒材,10μm。
图5
图5
在再生的早期阶段,AKAP450核MT涂有CLASP2。(一个B类)新西兰冲刷前后的CLASP2定位。在新西兰,CLASP2和AKAP450都与高尔基体和中心体(A)相关。NZ去除三分钟后,在含有元素(B,箭头)的AKAP450产生的新形成的MT处检测到CLASP2。A1和B1为微管蛋白染色的倒置图像;AKAP450(红色)和CLAPS2(绿色)染色的相同细胞如A2和B2所示。方框在右侧放大。棒材,10μm。
图6
图6
在BFA处理的细胞中,AKAP450依赖的MT成核活性重新分配到ERES。(一个——C类)双BFA-NZ处理的细胞在NZ洗脱染色AKAP450、微管蛋白和GMAP210后固定在0(A)、5(B)或10分钟(C)。A1–C1为微管蛋白染色的倒置图像。A2–C2是红色的AKAP450、绿色的微管蛋白和蓝色的GMAP210的合并图像。B和C中的箭头表示从ERES发出的MT。(D类——E类)AKAP450缺失细胞的类似实验。请注意,MT只从中心体生长。箭头表示中心体(CTR)。棒材,10μm。
图7
图7
AKAP450网络与cis-GA的对接由GM130介导。(一个B类)GMAP210(A3)染色显示,GM130(A1)的耗竭破坏AKAP450网络(A2),并轻微改变高尔基体形态。相反,GRASP65敲除(B1)既不影响AKAP450网络(B2),也不影响高尔基体带完整性(B3)。合并的图像以A4和B4显示。(C类D类)诺卡唑治疗对照(C)和GM130缺失(D)细胞。合并后的图像显示为红色的AKAP450、绿色的GMAP210和蓝色的GM130。(E类F类)NZ洗脱后5分钟,对照组(E)或GM130缺失细胞(F)标记AKAP450(红色)和α-微管蛋白(绿色)。顶部面板(E1和F1)显示了微管蛋白染色的倒置图像。(E)中的箭头表示MT从不同的中心生长,而它们表示单个MT从(F)中分散的AKAP450聚集体生长。显示中心体(CTR)。底部面板(E2和F2)为合并图像,微管蛋白为绿色,AKAP450为红色。条形图,10μm。(G公司)测定对照和GM130敲除细胞中含有从高尔基体生长的MT星号的细胞的百分比(n个=100个细胞,两个实验)。(H(H))RPE1细胞提取物与抗GM130抗体孵育。免疫沉淀物用WB分析AKAP450、GM130和α-微管蛋白作为阴性对照。或者,在转染YFP-GM130编码载体的RPE1细胞裂解物上用A24抗体进行免疫沉淀实验。WB分析了共同免疫沉淀蛋白AKAP450、YFP、α-微管蛋白作为阴性对照,GCP2作为阳性对照。使用无抗体珠作为对照(无AB IP)。
图8
图8
Dynein/dynactin复合体参与锚定在GA上的MT(一个B类)转染p150 CC1结构域的RPE1细胞的合并图像胶合的AKAP450(绿色)、Golgin245(蓝色)和CTR433(红色,A)或tubulin(红色,B)染色。A中的方框在右侧被放大,以显示AKAP450与中心体(箭头)和堆叠高尔基元素(箭头)的关联。(C类)p150中的MT重聚合实验胶合的CC1转染细胞。复温3分钟后,细胞固定并染色Golgin245(C1)、AKAP450(C2)和tubulin(C3)。图中显示了转染细胞(T)和非转染细胞。在C4中,合并后的图像显示AKAP450为绿色,微管蛋白为红色,Golgin245为蓝色。箭头表示转染细胞中含有AKAP450的高尔基体元件,这些元件不会使10μm的MTs.Bars成核。
图9
图9
AKAP450-depletion降低高尔基区MT乙酰化。(A1类——A3号)固定AKAP450缺失(D)和非缺失(ND)细胞,并标记AKAP450(A1)、乙酰化微管蛋白(A2)和GMAP210(A3,合并图像)。A1和A2为倒置图像。(A4)高尔基区含有乙酰化MT的AKAP450缺失或未缺失细胞百分比的图示(n个=200个细胞,两个实验)。(B类——G公司)将未耗尽的(B–D)或耗尽的(E–G)RPE1细胞冷处理40分钟(B,E),然后在RT下重新武装10分钟(C,F)或20分钟(D,G)。固定后,标记细胞乙酰化微管蛋白(乙酰-TU)和AKAP450。在每个图的左侧面板中,显示乙酰化MT的反转图像。在右侧面板中,绿色的乙酰化MT和红色的AKAP450标记的合并图像。条形图,10μm。
图10
图10
AKAP450缺失细胞在细胞迁移中有缺陷。(一个)以30分钟为间隔连续14小时对转染干扰siRNA或AKAP450 siRNA的活RPE1细胞进行成像。电影的第一帧(0分钟,顶部)和最后一帧(840分钟,底部)显示出来。为了估计第一帧和最后一帧控制和AKAP450缺失细胞中细胞覆盖的表面,使用了MethaMorph软件。(B类)为了进行追踪,在22小时内记录了干扰siRNA和AKAP450 siRNA转染的细胞。14个随机挑选的细胞的迁移轨迹用不同的颜色表示。箭头表示两个细胞出现正常迁移。(C类)创伤后8小时,固定siRNA AKAP-1转染的细胞,并用抗AKAP450(绿色)、抗GM130(红色)和DAPI(蓝色)染色。D、 耗尽细胞;ND,未完成细胞。白线表示划痕方向。伤口边缘细胞的高尔基体/中心体区域位于细胞核前面的象限内,面向伤口(如图所示),被视为方向正确。右侧,高尔基体/中心体方向正确的对照或敲除细胞的百分比。在击倒实验中,只计算耗尽的细胞(D)。结果显示为两个独立实验的平均值,每个条件下至少有200个细胞被评分。棒材,50μm。

中的注释

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