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.2009年4月；37(7):2070-86.
doi:10.1093/nar/gkp067。 Epub 2009年2月17日。

HMGB1和HMGB2蛋白上调人拓扑异构酶Ⅱα的细胞表达

米查尔·斯特罗斯 1, 伊娃·波兰斯卡, 索纳·斯特伦科娃, 萨尔卡·波斯皮西洛娃
附属公司

HMGB1和HMGB2蛋白上调人拓扑异构酶Ⅱα的细胞表达

米查尔·斯特罗斯等。 核酸研究. 2009年4月.

摘要

拓扑异构酶Ⅱα（topoⅡα）是一种核酶，参与染色体复制、分离和重组等关键过程。以前我们已经证明，染色体蛋白HMGB1与拓扑异构酶Ⅱα相互作用，并刺激其催化活性。这里我们展示了HMGB1对不同细胞系中人类拓扑异构酶Ⅱα基因启动子活性的影响。我们证明HMGB1，但不是不能弯曲DNA的HMGB1突变体，在缺乏功能性视网膜母细胞瘤蛋白pRb的人类细胞中上调拓扑异构酶Ⅱα启动子的活性。pRb-阴性Saos-2细胞中pRb的瞬时过表达抑制HMGB1激活topo-IIalpha启动子的能力。HMGB1/2的敲除进一步支持了HMGB1及其近亲HMGB2对topoⅡα基因活性的调节，topoⅡalpha mRNA和蛋白质水平显著降低就是证明。我们的实验表明，HMGB1/2通过调节转录因子NF-Y与topo IIalpha启动子的结合，上调pRb-阴性细胞中topo IIalpha的细胞表达，并在先前观察到的pRb失活的框架内对结果进行了讨论，肿瘤中HMGB1/2和topo-IIalpha水平升高。

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图1。
图1。
HMGB1上调人的活动拓扑IIα发起人。(A类)人体内元素的识别拓扑IIα参和HMGB1介导启动子上调的基因启动子。Saos-2细胞与含有-557 bp人类基因的质粒构建物共转染拓扑IIα启动子（质粒pTIIα-557）或截短的拓扑IIα与荧光素酶报告基因相关的启动子结构（详见材料和方法部分），以及编码HMGB1的质粒（或空载体）。插入标记HMGB1的过度表达。通道1，空载体转染细胞；泳道2，用编码Flag-HMGB1的质粒转染的细胞。使用特异性α-HMGB1抗体进行免疫检测。(B类)ICE2突变对小鼠脑组织反式激活的影响拓扑IIαHMGB1启动子。Saos-2细胞与含有全长的质粒共同转染拓扑IIα启动子（质粒pTIIα-617或pTIIβ-617_ICE2mt）或截断的拓扑IIα含有野生型（WT）或突变ICE2（ICE2mt）的启动子（质粒pTIIα-142或pTII a-142_ICE2mt），以及编码HMGB1的空载体或质粒。面板（A）和（B）中的荧光素酶活性（称为反式激活）是相对于拓扑IIαHMGB1无过表达的细胞裂解物中的启动子（取1）。每个转染实验用三份样品重复至少五次。数值表示为代表性实验中三份样品荧光素酶活性的平均值±1 SD（误差条）。
图2。
图2。
HMGB1与转录因子NF-Y相互作用并调节其与人类的结合拓扑IIα发起人。(A类)HMGB1增强了NF-Y与ICE2的结合。将放射性标记的含有ICE2的30 bp DNA双链与Saos-2细胞的核提取物（1区）或含有浓度增加的HMGB1（分别为1、2、3、4和6μM，2-5区）的核提取物混合，然后分离未结合的ICE2 DNA双链（自由探针）5%非变性聚丙烯酰胺凝胶（EMSA）上的DNA-蛋白质复合物。通过使用针对NF-YB的特异性多克隆抗体超移延迟复合物（箭头），验证了延迟复合物中是否存在NF-Y。核提取物与含有野生型ICE2的DNA双工体的NF-Y结合的特异性也通过含有ICE2野生型或突变序列的未标记DNA双工物的竞争实验证明（未显示）。(B类)HMGB1突变体不能弯曲DNA，不能增强NF-Y与ICE的结合。EMSA实验如（A）所示。1号车道，未增加HMGB1；车道2，野生型HMGB1（2μM）；泳道3，HMGB1（F38A/F103A），2μM。箭头表示（NF-Y）–DNA复合物的流动性。(C类)使用Saos-2细胞的染色质（对照组或HMGB1/2表达沉默后，见图6）进行使用抗NF-YB、对照IgG抗体或无抗体的ChIP分析，如材料和方法部分所述。NF-Y绑定到拓扑IIα在使用与启动子对应的引物进行PCR扩增后，通过凝胶染色（溴化乙锭）检测启动子，如材料和方法部分所述。对于半定量PCR，在线性扩增范围内进行扩增反应（通常为30–34个周期）。ChiP数据计算为ChIPed DNA的PCR信号与输入PCR信号的比率，最终数据通过两个细胞系（对照或HMGB1/2 sil）的比较获得，并表示为–倍变化。对照，稳定转染Saos-2细胞（载体）；HMGB1/2 sil，稳定转染的Saos-2细胞具有抑制的HMGB1/2表达（shRNA介导的HMGB1/2基因沉默，图6）。包含ICEs 1-3的195-bp特定PCR产物用箭头表示。M、 DNA大小标记；ICEs，反向CCAAT元素。(D类)检测NF-Y与HMGB1或pRb的结合在体外等量的GST、GST-HMGB1或GST-pRb固定在谷胱甘肽Sepharose珠上，并与Saos-2细胞的核提取物孵育。经过大量洗涤后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳洗脱和分离树脂结合蛋白，然后用W.印迹法和抗NF-YB抗体进行免疫学检测，详见材料和方法部分。EtBr、溴化乙锭。IN，25%的Saos-2细胞核提取物用于“下拉”分析（输入）。（底部）固定在琼脂糖珠上的GST或GST标记蛋白质用于“下拉”分析（考马斯蓝R-250染色）。
图3。
图3。
不能弯曲DNA的HMGB1不能上调人的活性拓扑IIα基因启动子。(A类)HMGB1结构域A（Phe38）和B（Phe103和Ile122）内嵌入残留物的位置。(B类)通过SDS/18%聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝R-250染色显示HMGB1、结构域A和B以及突变体的纯度。车道1，野生型HMGB1；HMGB1第2车道（F38A）；HMGB1第3车道（F103A）；HMGB1第4车道（F38A/F103A）[面板中指定为F/F(C类)和(D类)]; 车道5，HMGB1缺少C型尾翼（HMGB1-ΔC或A+B双域）；车道6，野生型域A；车道7，域A（F38A）；车道8，野生型域B；9号车道，B区（F103A）；车道10，域B（F103A/I122A）。(C类)HMGB1或HMGB1结构域A和B的突变插入氨基酸对T4 DNA连接酶介导的DNA环化的影响。连接酶介导的环化测定用32P标记的123-bp DNA双链，以及浓度为0.05、1和1.5μM的HMGB1或HMGB1-ΔC（从左到右，上面板）。对于单个HMGB1结构域的实验，A结构域或突变体的浓度为1.5、3和6μM，B结构域或突变的浓度为0.5、1和1.5μM（从左到右，下面板）。用T4 DNA连接酶连接DNA-蛋白质复合物，然后在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离脱蛋白DNA样品。(D类)的事务激活拓扑IIαHMGB1或HMGB1-ΔC双突变体的基因启动子。编码HMGB1或突变体的质粒与质粒pTIIα-617共同转化到Saos-2细胞中，如图1所示测量荧光素酶活性（反式激活）。
图4。
图4。
HMGB1上调人类拓扑IIαpRb-阴性细胞中的基因启动子。(A类)携带人的质粒pTIIα-617拓扑IIα基因启动子与载体（空条）或编码HMGB1的质粒（黑条）共转染pRb-阴性Saos-2细胞或pRb--阳性H1299或MCF-7细胞。(B类)人类活动的上调拓扑IIαHMGB1的启动子被野生型而非突变型pRb抑制。将质粒pTopoIIα-617和编码野生型视网膜母细胞瘤蛋白pRb、突变型pRb（氨基酸706 C→F） 或人类HMGB2。测量（A）和（B）中的荧光素酶活性（反式激活），如图1所示。(C类)在H1299细胞中敲除pRb。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳解析来自未转染细胞（1区）、转染对照siRNA（2区）或Rb特异性siRNA（3区）的细胞核裂解物，然后将蛋白质转移到膜上，并使用抗pRb或抗肌动蛋白抗体进行免疫检测。(D类)HMGB1显著刺激拓扑IIαpRb敲除后H1299细胞中的基因启动子。对照siRNA或Rb特异性siRNA与质粒pTIIα-617和空pcDNA3载体或编码HMGB1的质粒瞬时共转染到pRb-阳性H1299细胞中，详见材料和方法一节。荧光素酶活性（反式激活）如图1所示。(E类)HMGB1与H1299细胞中pRb的相互作用。用单克隆α-HMGB1抗体或对照（免疫前）IgG免疫沉淀（IP）pRb-阳性Saos-2细胞的细胞裂解物，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离沉淀蛋白，使用多克隆抗pRb抗体进行免疫印迹和免疫检测，详见材料和方法部分。(F类)用于“下拉”分析（上面板）的pRb和pRb结构的示意图结构。GST或GST-pRb（野生型或突变型）固定在谷胱甘肽Sepharose微球上，并与纯化HMGB1蛋白孵育。在对珠子进行大量清洗后，与珠子相关的蛋白质进行分离电泳，然后进行蛋白质印迹和α-HMG11抗体的免疫学检测，详见材料和方法一节。通过使用抗pRb（C-15）抗体的免疫检测（泳道2和3）证实了固定在珠子上的等量GST-pRb。输入10%的HMGB1用于下拉分析。
图5。
图5。
(A类)pRb可以减少NF-Y与ICE的结合。将含有ICE2的放射性标记的30 bp DNA双链与Saos-2细胞的核提取物（第1道）或含有越来越多重组His-pRb的核提取物混合[第2道（0.1μg）、第3道和第7道（0.2μg），第4道和第8道（0.4μg）]。在一些反应中，添加HMGB1[车道5（1μM），车道6-8（4μM）]。在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶（EMSA）上解析未结合的DNA双工体（自由探针）和DNA-蛋白质复合物。(B类)人类上调拓扑IIβHMGB1和HMGB2基因启动子。携带人的质粒-700TOP2B-pGL3拓扑IIβ基因启动子与pGL3载体（空条）、编码HMGB1的质粒（黑条）或编码HMGB2的质粒（灰条）共转染到Saos-2细胞中。荧光素酶活性如图1所示。
图6。
图6。
敲低HMGB1和HMGB2会抑制topo IIα的表达。来自未转染（1区）和模拟转染（2区）细胞以及转染质粒产生HMGB1（3区，结构#A）或HMGB1/HMGB2（4区，结构#1B）特异shRNAs的细胞的核裂解物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并通过western blotting转移到膜上。蛋白质由特定抗体检测，详见材料和方法部分。
图7。
图7。
人类活动的调节拓扑IIαpRb和HMGB1/2基因和拓扑异构酶IIα（假设）。HMGB1和HMGB2蛋白上调人类的表达拓扑IIαpRb-阴性细胞中的基因通过增强转录因子NF-Y与其特定DNA结合位点（ICEs）的结合拓扑IIα基因启动子。HMGB1/2预弯曲DNA序列有助于NF-Y与ICE的结合。pRb可以抑制拓扑IIα基因，以及HMGB1上调基因表达的能力，可能是通过减少NF-Y与ICE的结合（本文）。HMGB1/2促进拓扑异构酶IIα的细胞表达（本文），如前所述，这些蛋白质还具有增强酶催化活性的潜力在体外（11和未发表的结果）。p53抑制拓扑IIα基因通过破坏NF-Y结合（24,45）。与pRb对topo IIα（22）催化活性的抑制作用不同，该酶由p53（46）刺激。
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