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.2009年2月；20(4):1192-200.
doi:10.1091/mbc.e08-08-0834。 Epub 2008年12月24日。

高尔基体Cdc42活性的GM130依赖性控制调节中心体组织

安德鲁·科达尼 1, 艾琳·克里斯滕森, 兰黄（Lan Huang）, 克里斯汀·苏特林
附属公司

高尔基体对Cdc42活性的GM130依赖性控制调节中心体组织

安德鲁·科达尼等。 分子生物学细胞. 2009年2月.

摘要

高尔基体和中心体的物理邻近性是哺乳动物细胞的一个独特特征，其功能意义尚不清楚。在这里，我们证明了先前描述的高尔基体蛋白GM130对中心体组织和功能的调节涉及高尔基体相关复合物，该复合物由GM130、Rho GTPase、Cdc42及其鸟嘌呤核苷酸交换因子Tuba组成。我们确定Tuba是一种新的GM130相互作用蛋白，并表明这种关联控制Tuba介导的高尔基体Cdc42的激活。阻断Tuba或Cdc42活性可再现异常、无功能中心体的GM130缺失表型。组成活性Cdc42的表达绕过了GM130在中心体调控中的要求，表明Cdc42在GM130下游发挥作用。我们的研究表明，Cdc42除了作为受刺激细胞中心体重新定向的调节器的已知功能外，在控制未受刺激细胞中的中心体组织方面还具有新的作用。首次描述了高尔基体和间期中心体之间的调控途径，该调控途径补充了高尔基蛋白在有丝分裂期间控制纺锤体形成的已知作用，并可能解释了哺乳动物高尔基体在间期的近中心点位置。

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数字

图1。
图1。
Cdc42全球环境基金Tuba与GM130有约束力。（A） 用检测Tuba和Tuba亚型mTuba的多克隆抗体GM130（IP GM130）、Tuba（IP Tuba）或作为阴性对照的FLAG表位（FLAG IP）对HeLa细胞总裂解物进行免疫沉淀。用SDS-PAGE分离免疫沉淀物，并用GM130、Tuba和β-PIX抗体进行Western blotting分析。输入相当于50μg总裂解液，而每次免疫沉淀都是从2 mg总裂解液中进行的。显示了GM130免疫沉淀中GM130和Tuba含量的定量。（B） 在单独的体外转录和翻译反应中合成重组HA标记的Tuba、FLAG-标记的GM130或FLAG-标签的GM130ΔN690。将样品混合，以便结合或作为阴性对照物分开保存。通过共免疫沉淀实验分析蛋白质相互作用，其中使用GM130特异性抗体从单独或混合的体外反应中免疫沉淀GM130，然后使用Tuba和GM130特异抗体进行Western blot分析。输入材料对应于每个免疫沉淀反应的25%。
图2。
图2。
Tuba和GM130调节未刺激细胞中的Cdc42激活。（A） Cdc42活性测定是通过将来自未刺激对照（对照siRNA）和去Tuba（Tuba siRNA）U2-OS细胞的总裂解物与Cdc42效应器的重组CRIB结构域p21-活化激酶（GST-CRIB-PAK）孵育来进行的，该结构域与活化的GTP-结合形式的Cdc42（Benard等。，1999年）。用Cdc42特异性抗体进行Western blotting，测定细胞总Cdc42（total Cdc42）和活化Cdc42的水平。α-管蛋白作为负荷控制。（B） 如图2A所示，还对对照细胞和GM130缺失细胞进行了Cdc42活性分析。（C） 图中显示了活化GTP-Cdc42/总Cdc42比率的量化，作为对照的百分比。图像J用于这些量化。这些实验重复三次，计算平均值和SD。
图3。
图3。
GM130、Tuba和Cdc42形成Golgi相关复合物。（A） 用GFP标记的显性阴性形式的Cdc42（Cdc42无活性＝Cdc42 N17）转染HeLa细胞。制备细胞裂解物，并与β-PIX（IPβ-PIX）、Tuba（IP Tuba）或GM130（IP GM130）抗体孵育。用GM130、Tuba、β-PIX和GFP抗体进行Western blotting检测共免疫沉淀蛋白的存在。输入相当于每次免疫沉淀所用细胞总裂解液的2.5%。（B） 表达GFP标记的显性阴性Cdc42或GFP的细胞作为对照，用GFP特异性抗体进行免疫沉淀。免疫共沉淀蛋白用Tuba、GM130和GFP抗体进行免疫印迹分析。（C） 对表达显性阴性Cdc42（GFP-Cdc42无效）的对照细胞或GM130缺失细胞进行Tuba特异性抗体（IP-Tuba）免疫沉淀。免疫印迹法测定共免疫沉淀GM130和GFP标记的Cdc42的数量。总裂解物相当于免疫沉淀起始物质的2.5%。（D） GM130缺失细胞中Tuba结合的Cdc42的定量，作为对照水平的百分比（n=3）。（E） 左侧，盖玻片上生长的U2-OS细胞与GM130、Tuba和DNA染料Hoechst抗体共染。右图，U2-OS细胞用GFP标记的显性阴性Cdc42（Cdc42无活性）转染。用GM130抗体观察到GM130，而GFP信号显示显性阴性Cdc42的定位。比例尺，10μm。
图4。
图4。
GM130、Tuba和Cdc42是细胞周期中正常中心体组织和功能所必需的。（A） 对照组（对照shRNA）或GM130-depleted（GM130-shRNA）U2-OS细胞用GM130抗体染色以确认蛋白敲除，中心粒标记Centrin2染色以可视化中心体的组织和位置（大图）。这些中心体的进一步特征是与中心蛋白2（标记为C）和中心粒周标记蛋白γ-微管蛋白（γ；小插入物）结合。对被siRNA耗尽的Tuba也进行了类似的实验。（B）在U2-OS细胞中检测中心体的组织和位置，其中Cdc42的激活被GFP标记的显性阴性Cdc42（非活性）阻断。GFP标记的组成活性Cdc42（active=Cdc42 V12）作为阴性对照。比例尺（A和B）5μm。（C） 具有异常中心体的细胞百分比（定义为具有>4个Centrin2阳性病灶的中心体）由三个独立实验测定，用于计算平均值和SD。
图5。
图5。
GM130、Tuba和Cdc42失活产生异常中心体，在间期和有丝分裂期间无法组织微管。（A） 用α-微管蛋白抗体观察对照组或GM130和Tuba缺失的U2-OS细胞的微管组织。分别用GM130或Tuba的特异性抗体验证GM130或Tuba的缺失。微管组织中心用箭头标记。（B） 如图5A所示，转染GFP标记的组成活性和显性阴性形式Cdc42的U2-OS细胞中的微管组织。GFP荧光验证了这些结构的表达和高尔基体定位。比例尺（A和B）10μm。（C） 有丝分裂HeLa细胞中，GM130和Tuba的功能被RNAi介导的蛋白耗竭灭活，用α-微管蛋白抗体和DNA染料Hoechst分别染色，以观察有丝分裂纺锤体的组织和DNA的排列。（D） 有丝分裂HeLa细胞中表达显性阴性（非活性）或组成性活性（活性）Cdc42的纺锤体组织分析。比例尺，（C和D）5μm。（E） 显示了有丝分裂细胞中纺锤体组织异常的百分比。这些实验重复三次，计算平均值和SD。（F） 有丝分裂中细胞百分比的定量，通过用磷酸-胆固醇H3（n=3）的特异性抗体染色确定。
图6。
图6。
组成活性Cdc42绕过了中心体组织中GM130的要求。（A） 用对照（对照shRNA）或GM130特异性短发夹（GM130 shRNA）转染U2-OS细胞72 h，并用GFP或GFP标记的组成活性Cdc42（Cdc42 active=Cdc42 V12）再次转染U2-OS细胞。因为组成活性Cdc42的表达超过36小时会导致细胞死亡（数据未显示），所以我们延迟36小时进行第二次转染。肌动蛋白作为负载控制。（B） 对含有GFP（+GFP）或GFP标记的组成活性Cdc42（+GFP-Cdc42活性）的对照细胞和GM130缺失细胞进行Centrin2抗体染色，以确定初始转染72小时后中心体的组织。显示了中心蛋白2阳性病灶>4的细胞百分比。这些实验重复三次，计算平均值和SD。
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  • 高尔基体在癌细胞侵袭和转移中的适应性。
    Bui S、Mejia I、Díaz B、Wang Y。 Bui S等人。 前细胞发育生物学。2021年12月10日；9:806482. doi:10.3389/fcell.2021.806482。eCollection 2021年。 前细胞发育生物学。2021 PMID：34957124 免费PMC文章。 审查。
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    1. Alvarez C.、Garcia-Mata R.、Hauri H.P.、Sztul E.。p115相互作用蛋白GM130和giantin参与内质网-高尔基体的运输。生物学杂志。化学。2001;276:2693–2700.-公共医学
    1. Ando Y.、Yasuda S.、Oceguera Yanez F.、Narumiya S.艰难梭菌毒素B对Rho GTP酶的灭活损害了HeLa细胞G2/M过渡中Aurora-A的中心体激活。分子生物学。单元格。2007;18:3752–3763.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Benard V.，Bohl B.P.，Bokoch G.M.使用活性GTPases的新检测方法对趋化剂刺激的人类中性粒细胞中rac和cdc42活化的表征。生物学杂志。化学。1999;274:13198–13204.-公共医学
    1. Chang P.、Coughlin M.、Mitchison T.J.Tankyrase-1聚（ADP-核糖）聚合是纺锤结构和功能所必需的。自然细胞生物学。2005;7:1133–1139.-公共医学
    1. Dubois T.、Paletti O.、Mironov A.A.、Fraisier V.、Stradal T.E.、De Matteis M.A.、Franco M.、Chavrier P.Golgi对ARF1下游Cdc42功能的GAP进行了放大，以控制Arp2/3复合物和F-actin动力学。自然细胞生物学。2005;7:353–364.-公共医学

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