跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2009年2月;37(2):431-40.
doi:10.1093/nar/gkn955。 Epub 2008年12月2日。

WT1和BASP1在分化过程中转录调控的动态相互作用

附属公司

WT1和BASP1在分化过程中转录调控的动态相互作用

劳拉·M·格林等。 核酸研究. 2009年2月.

摘要

Wilms的肿瘤抑制蛋白WT1在肾脏和其他器官的发育中起着重要作用。WT1可以作为一种具有高度上下文特异性激活和阻遏功能的转录因子。我们之前确定脑酸可溶性蛋白1(BASP1)是一种转录共抑制剂,可以阻断WT1的转录激活功能。WT1和BASP1在肾发生过程中共同表达,这两种蛋白最终局限于成人肾脏的足细胞细胞。在这里,我们分析了足细胞前体细胞系中可以诱导分化的WT1/BASP1复合物。染色质免疫沉淀显示,WT1和BASP1占据足细胞前体细胞中Bak、c-myc和足细胞粘连蛋白基因的启动子。在分化过程中,与WT1相比,podocalyxin启动子的BASP1占用率降低,这与podocaly xin表达的上调有关。相反,c-myc和Bak启动子的抑制性WT1/BASP1占据保持不变,这些基因在分化过程中下调。我们提供证据表明,BASP1启动子占用的调控涉及BASP1的合成。我们的结果揭示了WT1和BASP1在分化过程中基因表达调控方面的动态合作。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
WT1和BASP1在MPC5足细胞前体细胞中的定位。(A)用兔抗WT1(红色)和羊抗BASP1(绿色)抗体对MPC5细胞进行免疫荧光。右下面板显示了两幅图像的合并,以及所示两个单元格的放大图像。用Hoechst对细胞进行复染。下面显示了用绵羊和兔子的二级抗体控制免疫荧光。(B)用MPC5细胞制备的核提取物进行凝胶过滤,并用抗WT1抗体(顶部)或兔抗BASP1抗体(底部)进行免疫印迹。校准(单位:千道尔顿)位于放射自显影照片上方,分数位于下方,分子量标记(单位:千道尔顿)在左侧。重量1,基础140和BASP152都用箭头表示。与BASP1共分馏的WT1络合物被装箱。虚线表示免疫印迹在一起的两个单独凝胶的排列。
图2。
图2。
MPC5细胞的分化。(A)按照顶部指示的时间分化小鼠MPC5细胞。然后固定细胞,用抗微管蛋白或抗突触体抗体(均为绿色)进行免疫荧光,并用Hoechst进行反染色。(B)MPC5细胞在指定的天数内分化,并制备总RNA。采用半定量RT-PCR检测WT1、CSF1、PDGFA、Bak、c-myc、Podocalyxin和GAPDH。
图3。
图3。
WT1和BASP1在分化MPC5细胞中的启动子占有。(A)用未分化MPC5细胞(0)或分化5天的MPC5电池(5)进行ChIP。ChIP中使用的抗体为兔抗GAL4抗体(αCtrl)、抗乙酰化组蛋白H3(αAcH3)、兔抗WT1抗体(αWT1。使用直接引物对小鼠PDGFA启动子(顶部)或CSF1启动子(底部)进行PCR扩增。I是每个免疫沉淀中输入染色质的1/50。右侧显示了每个启动子区域的示意图,并指明了WT1 DNA结合位点和正向/反向引物区域的位置。(B)除分析Bak(顶部)和c-myc(底部)启动子外,ChIP与A部分相同。(C)如(A)所示,但分析是用未分化的MPC5细胞(0)和允许分化3(3)和5(5)天的细胞进行的。底部面板是未分化MPC5细胞的ChIP分析中podocalyxin基因(Int.)内部区域的扩增。
图4。
图4。
BASP1在足细胞分化过程中发生改变。(A)MPC5细胞在指定的天数内分化,然后制备全细胞裂解物,并用抗WT1(顶部)、抗BASP1(中部)或抗管蛋白(底部)抗体进行免疫印迹。显示了短时间和长时间暴露的抗BASP1斑点。分子量标记(千道尔顿)如左图所示。WT1、微管蛋白、BASP140以及BASP1的~60-kDa形式。(B)BASP1的示意图显示了肉豆蔻酰化基序(m)、核定位序列(NLS)、潜在磷酸化位点(P)和保守的潜在sumo修饰位点(S)。装箱区域是PEST序列。下面,驱动野生型HA标记的BASP1或BASP1 K78R表达的质粒:K83R被单独转染到293细胞中,或与驱动his标记的SUMO-1或SUMO-3表达的质粒一起转染。48小时后,在变性条件下制备提取物,纯化his标记的衍生物并用抗HA抗体进行免疫印迹。分子量标记(以千道尔顿为单位)显示在左侧。下面的放射自显影显示了镍螯合亲和纯化前用全细胞裂解物的抗BASP1抗体进行的免疫印迹。(C) GST或其标记的BASP1表达于大肠杆菌要么停泊要么缺乏连接sumo-3的设备。细菌裂解物通过电泳分离,并用抗BASP1抗体进行免疫印迹。分子量标记如左图所示。BASP1公司52和与摘要相关的BASP1修改形式用箭头表示。
图5。
图5。
BASP1作为WT1转录共抑制剂具有sumo依赖和sumo非依赖功能。(A)用0.5μg的足细胞粘连蛋白启动子-荧光素酶(LUC)报告子转染K562细胞,转染后有或无(ΔWRE)WT1结合位点。如果显示pcDNA3-HA-BASP1或pcDNA3-HA-BASP1K78R:K83R(0.1μg和0.5μg)也被转染。48小时后,采集细胞并测量荧光素酶活性,并在缺少BASP1的情况下,相对于野生型足爪藻毒素报告子的荧光素素酶活性进行显示。条形图是具有标准偏差的三个独立实验的平均值。星号表示-检验显著性优于95%。右侧显示了带有抗BASP1抗体的全细胞裂解物的免疫印迹,(B)用G5TKCAT报告子和pcDNA3或pcDNA3-GAL4(残基1-94)、GAL4-EVE、GAL4-BASP1或GAL4-BASP1 K78R:K83R转染人类胚胎肾293细胞。48小时后,采集细胞,测量CAT活性,并在没有GAL4融合蛋白的情况下与报告活性相对。条形图是具有标准偏差的三个独立实验的平均值。(C)如(B)所示,但使用了Lex/Gal荧光素酶报告子,并且包含了驱动LexA-VP16表达的质粒。
图6。
图6。
BASP1的Sumoylation影响其核内定位。(A)使用兔抗BASP1抗体(顶部,红色)或单独使用二级抗体(底部)对MPC5细胞进行免疫荧光。每个面板的Hoechst染色如下所示。(B)用羊抗BASP1(绿色)和兔抗PML(红色)抗体对MPC5细胞进行免疫荧光。两幅图像的合并显示在底部面板中。这些图像是用Deltavision显微镜拍摄的。(C)将野生型HA标记的BASP1或突变衍生物(K78R:K83R)转染到K562细胞中。48小时后,提取全细胞提取物(左)或细胞核并进行亚分离(右)。样品通过电泳分离,并用抗BASP1抗体进行免疫印迹。分子量标记(千道尔顿)如左图所示。BASP1公司40和BASP1~60 kDa用箭头表示。(D)未分化MPC5细胞或分化5天的MPC5电池按(C)进行分析,以检测细胞核可溶性、染色质和基质室中的内源性BASP1。BASP1公司40以及BASP1的~60-kDa形式。
图7。
图7。
足细胞分化过程中WT1和BASP1在转录调控中的动态合作模型。在未分化的MPC5细胞中,WT1与podocalyxin(左)和Bak或c-myc(右)启动子结合。分化后,podocalyxin基因上调,而Bak和c-myc启动子下调。BASP1的分化依赖性sumoylation与podocalyxin启动子分离,但仍与Bak和c-myc启动子结合。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Rivera MN,Haber DA。Wilms肿瘤:连接肿瘤发生和肾脏器官发育。Nat.Rev.癌症。2005;5:699–712.-公共医学
    1. Yang L、Han Y、Saurez Saiz F、Minden MD。肿瘤抑制基因和癌基因:WT1故事。白血病。2007;21:868–876.-公共医学
    1. Hohenstein P,Hastie ND。威尔姆斯的肿瘤基因WT1的许多方面。嗯,分子遗传学。2006;15:196–201.-公共医学
    1. Scholz H,Kirschner KM。Wilms肿瘤蛋白WT1在器官发育中的作用。生理学。2005;20:54–59.-公共医学
    1. Hammes A,Guo J,Lutsch G,Lehester J,Landrock D,Ziegler U,Gubler M,Schedl A。Wilms肿瘤1基因的两个剪接变异体在性别决定和肾单位形成过程中具有不同的功能。单元格。2001;106:319–329。-公共医学

出版物类型

MeSH术语