Intermolecular interactions identify ligand-selective activity of estrogen receptor alpha/beta dimers

doi:10.1073/pnas.0807274105

.2008年12月2日；105(48):19012-7.

doi:10.1073/pnas.0807274105。 Epub 2008年11月20日。

分子间相互作用鉴定雌激素受体α/β二聚体的配体选择性活性

艾米莉·鲍威尔¹, 魏旭

附属公司

PMID： 19022902
预防性维修识别码：项目经理2596243
内政部： 10.1073/pnas.0807274105

分子间相互作用鉴定雌激素受体α/β二聚体的配体选择活性

艾米莉·鲍威尔等。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年12月2日；105(48):19012-7.

doi:10.1073/pnas.0807274105。 Epub 2008年11月20日。

作者

艾米莉·鲍威尔¹, 魏旭

附属

¹威斯康星大学麦卡德尔癌症研究实验室，美国威斯康星州麦迪逊大学大道1400号，邮编53706。

PMID： 19022902
预防性维修识别码：项目经理2596243
内政部： 10.1073/pnas.0807274105

摘要

雌激素受体（ER）二聚体是其激活靶基因转录的先决条件。由于ERalpha和ERbeta这两种形式的ER在细胞增殖中表现出相反的功能，配体诱导ERalpha/β异二聚体与其各自的同源二聚体的能力预计将对转录结果和细胞生长产生深远影响。然而，目前缺乏直接方法来监测体内ERalpha/β异二聚体的形成，并区分雌激素配体促进ER同型与异二聚的能力。在这里，我们描述了生物发光共振能量转移（BRET）分析，用于监测活细胞中ERalpha/β异二聚体及其各自同源二聚体的形成。我们证明，虽然这两个伙伴都有助于异二聚体形成，但配体结合ERalpha起主导作用。此外，发现一种生物活性成分可诱导ERbeta/β同型二聚体和ERalpha/β异二聚体，但对ERalpha/α同型二聚体的活性最低，这就提出了一个模型，即促进ERalpha/β异二聚体形成的化合物可能具有治疗价值。因此，ER同二聚体和异二聚体BRET分析适用于二聚体选择性ER调节剂的药物筛选。此外，该策略可用于研究其他核受体二聚体。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
BRET融合蛋白中的ER具有功能性。(A类)蛋白质印迹显示蛋白质表达。(B)抗体与ERα共免疫沉淀，然后使用ERβ抗体进行Western印迹(上部)或ERα抗体(下部). (C类)转染细胞的全细胞配体结合测定。(D类)使用转染细胞制备的核提取物进行电泳迁移率变化分析。箭头表示抗体存在时的超移带。误差条代表SEM(E类)测量转染有指示构建物和ERE报告物的细胞的荧光素酶单位，并将其归一化为β-半乳糖RLU，即相对荧光素单位。

**图2。**
BRET分析的优化。(A类)改变RLuc-YFP融合比决定了共振能量转移的效率。(B)电子₂剂量-反应曲线显示所有3对ER的配体依赖性二聚化。(C类)旁观者BRET分析表明，ERβ同型二聚体的背景BRET信号是由配体诱导的二聚体引起的，而ERα同型二聚体和ERα/β异二聚体条件的背景BRET信号是由RLuc和YFP融合体之间的随机碰撞引起的。(D类)100 nM E存在下二聚体随时间的形成₂所有3种ER组合都会快速发生。误差条代表SEM。

**图3。**
ERα是ERα/β异二聚体中的主要伴侣。(A类)低浓度PPT通过与ERα结合导致异二聚，但低浓度DPN不会通过与ERβ结合导致异二聚化。PPT和DPN在这种低浓度下对其各自的亚型具有特异性。(B)在没有配体结合ERβ的情况下，配体结合到ERα可以诱导二聚化，尽管除非ERβ的LBD也是野生型，否则无法实现最大的二聚化潜能。误差条代表SEM。

**图4。**
不同的ER激动剂和拮抗剂在3对二聚体中诱导不同的构象。(A类)根据配体亲和力，激动剂配体在二聚体对之间诱导类似构象。拮抗剂配体诱导不同的构象（将每个灰色条与每个黑色条进行比较），也可以相互比较（在3个灰色条之间进行比较）。这些拮抗剂还诱导3对二聚体之间的不同构象（例如雷洛昔芬）。(B)蛋白质印迹显示，1小时配体处理不会导致瞬时转染的融合蛋白的降解。误差条代表SEM。

**图5。**
天然存在的雌激素配体表现出二聚体对选择性。(A类)Genistein在10 nM时诱导ERβ同二聚，而在100 nM的下限时显著诱导ERα同二聚和ERα/β异二聚。(B)甘草素在1μM时诱导ERβ同型二聚体和ERα/β异二聚体，但在此浓度下不诱导ERα同型二聚体(上部). 甘草素通过与ERα结合诱导异二聚体形成(下部)尽管发现ERα同型二聚体在该浓度下不被诱导。误差条代表SEM。

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