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比较研究
.2008年11月11日；105(45):17420-5.
doi:10.1073/pnas.0710725105。 Epub 2008年11月5日。

副纤维蛋白抑癌蛋白通过抑制c-myc原癌基因抑制细胞增殖

玲玲 1, 张建华, Leelamma M恐慌症, 威廉·西蒙兹
附属公司
比较研究

副纤维蛋白抑癌蛋白通过抑制c-myc原癌基因抑制细胞增殖

玲玲等。 美国国家科学院程序. .

摘要

副纤维蛋白是一种由HRPT2编码的肿瘤抑制蛋白，HRPT2基因最近与遗传性甲状旁腺功能亢进症-颌骨肿瘤综合征、甲状旁腺癌以及家族性孤立性甲状腺炎家族的一部分有关。人类副纤维蛋白作为PAF1转录调控复合物的一部分与RNA聚合酶II结合。副纤维蛋白的生理靶点及其功能丧失导致肿瘤转化的机制尚不清楚。我们在此表明，RNA干扰副纤维蛋白或Paf1的表达可刺激细胞增殖，并增加c-myc原癌基因产物、一种DNA结合蛋白和已建立的细胞生长调节因子的水平。这种效应是由于c-myc蛋白的稳定和c-myc启动子的激活，而没有缓解c-myc转录暂停。染色质免疫沉淀显示c-myc启动子被副纤维蛋白和天然细胞中的其他PAF1复合亚单位占据。敲除c-myc可阻断RNA干扰副纤维蛋白或Paf1表达的增殖效应。这些实验为PAF1复合介导的c-myc原癌基因抑制所产生的副纤维蛋白抑癌蛋白的抗增殖作用提供了一种以前未被证实的机制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
RNA干扰人力资源计划2或第1页人类细胞中的表达导致内源性Paf1和Leo1表达下调，细胞增殖增加。(A类和B类)副纤维蛋白的免疫印迹分析(顶部面板)，Paf1(第二个面板)，Leo1(第三个面板)RNAi介导的HeLa细胞中人力资源计划2或第1页抄本。用对照siRNA或二者之一处理细胞人力资源计划2-或第1页-特定的siRNA，并按照方法β-肌动蛋白的表达显示为负载对照(第四个面板). (C类和D类)RNAi抑制副纤维蛋白或Paf1表达导致S期细胞数量增加。用对照siRNA或两种siRNA中的一种处理HeLa细胞人力资源计划2-或第1页-特定siRNA并进行FACS分析，如方法. (D）直方图显示了不同细胞周期群体的分布；这些值代表了两个具有类似结果的独立实验。S期和G1期差异的显著性由Student’S评估t吨测试（***，P（P）< 0.001). (E类和F类)扩散分析。文化赫拉(E类)或NHDF细胞(F类)按上述方法处理48小时。通过比色细胞增殖试验评估细胞增殖。给出了代表三个单独重复的数据。差异的显著性由Student’st吨测试(***P（P）< 0.005, **,P（P）< 0.01, *,P（P）< 0.05).
图2。
图2。
RNAi介导抑制HeLa细胞、U2-OS细胞和NHDF细胞c-myc蛋白表达人力资源计划2或第1页表达式。(A类)用对照siRNA或两种siRNA中的一种处理HeLa细胞人力资源计划2-或第1页-特异性siRNA持续48小时，然后用抗c-myc抗体对细胞进行免疫印迹分析(顶部面板)，抗副纤维蛋白(第二个面板)，抗Paf1(第三个面板). (B类和C类)基于Western blot分析，如图S7定量ECL对c-myc表达进行量化，然后归一化为肌动蛋白表达。差异的显著性由Student’st吨测试（***，P（P）< 0.005, **,P（P）<0.01，P（P）< 0.05). (D类)用对照siRNA处理U2-OS细胞和NHDF细胞，人力资源计划2-或第1页-方法中描述的特定siRNA。治疗48小时后，分析细胞c-myc的表达(顶部面板)，副纤维蛋白(第二个面板)，Paf1(第三个面板). 在A类和D类β-actin的表达表现为负荷控制。
图3。
图3。
分析c-myc蛋白的稳定性和半衰期，以应对副纤维蛋白或Paf1表达的抑制。(A类和B类)用对照siRNA处理培养的HeLa细胞，人力资源计划2-或第1页-特异性siRNA。转染后48小时，将环己酰亚胺（CHX）添加到培养基中，并在0、20、40、80和100分钟收集细胞。使用抗c-myc或抗肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。(C类)免疫印迹法分析零时间点副纤维蛋白和/或Paf1的表达。β-肌动蛋白的表达显示为负载对照。(D类和E类)对照组和HRPT2-中c-myc蛋白表达相对强度自然对数的线性回归分析(D类)或Paf1-(E类)显示了CHX处理不同时间的特定siRNA处理细胞，通过定量ECL分析进行量化，并归一化为β-肌动蛋白表达。在该分析中，所有曲线图在时间=0时的y值为4.61（100[%]相对表达的自然对数），y值为3.91（表示50[%]的相对表达）对应于c-myc蛋白半衰期对应的时间。
图4。
图4。
c-Myc是控制细胞增殖的Paf1复合物的下游。(A类)在有对照的情况下，用80 nM的c-myc siRNA处理HeLa细胞，HRPT2型-或第1页-特异性siRNA。RNAi介导的基因沉默c-myc公司(顶部面板),人力资源计划2(第二个面板)和第1页(第三个面板)免疫印迹分析评价。(B类)对于细胞增殖测定用对照siRNA处理HeLa细胞，人力资源计划2-或第1页-在缺乏或存在80 nMc-myc公司-特异性siRNA。治疗48小时后，通过方法中描述的比色分析评估增殖。数据代表了三个具有类似结果的重复序列。(C类)对照组HeLa细胞中c-Myc的表达，人力资源计划2-或第1页-在存在0、20或40 nMc-myc公司-特异性siRNA。基因沉默效率c-myc公司(顶部面板),人力资源计划2(第二个面板)和第1页(第三个面板)通过Western blot分析监测。(D类)HeLa细胞经人力资源计划2-或第1页-在0、20或40nM的c-myc公司-通过比色法评估特异性siRNA。数据代表了三个具有类似结果的独立实验。差异的显著性由Student’st吨测试（**，P（P）< 0.01, *,P（P）< 0.05). 在A类和C类β-actin的表达表现为负荷控制。
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