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.2008年11月25日;47(47):12614-25.
doi:10.1021/bi801475r。

Hsp70和α-突触核蛋白疏水核心之间的相互作用抑制原纤维组装

附属公司

Hsp70与α-同核蛋白疏水核的相互作用抑制纤维组装

开尔文·C·卢克等。 生物化学. .

摘要

热休克蛋白70(Hsp70)家族的分子伴侣可抵消各种神经退行性疾病模型中的蛋白质错误折叠。为了确定人类Hsp70是否对帕金森氏病中不溶性纤维的关键成分α-同步核蛋白(alpha-Syn)的聚集产生类似的影响,我们研究了Hsp70存在下α-Syn纤维的聚集。我们发现,在没有辅因子的情况下,纯化的Hsp70的亚化学计量浓度可有效抑制体外组装。使用α-Syn缺失突变体的实验表明,Hsp70底物结合域和α-Syn-核心疏水区之间的相互作用是组装抑制的基础。由于我们未能通过电子显微镜检测到任何纤维,因此在伸长阶段之前,组装过程受到抑制。此外,荧光偏振和结合分析表明,Hsp70以高度动态和可逆的方式识别可溶性α-Syn物种。总之,这些结果为研究Hsp70如何抑制α-Syn聚集提供了新的见解。此外,我们的研究结果表明,帕金森病发病机制中的这一关键步骤可能受到一种常见分子伴侣的调节。

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图1
图1。Hsp70抑制体外α-Syn原纤维组装
组装缓冲液中的单体重组α-Syn(72μM)在384孔板(每次反应20μL)中与纯化的Hsp70或BSA(7.2μM)孵育。在不同时间点取出平行样品(每个10μL),并用ThT监测α-Syn原纤化(一个)或K114(B类)荧光。亚化学计量量的Hsp70(相对于单体α-Syn为1:10)阻止了α-Syn淀粉样原纤维的增加,正如这两种染料所表明的那样。C类培养96小时后,测量含有α-Syn(72μM)与不同浓度Hsp70或BSA(0.72-7.2μM)的反应的ThT荧光。用Hsp70而不是BSA以浓度依赖的方式观察到α-Syn纤维组装受到抑制。数据表示为平均值±标准偏差(n个=每浓度3-4,2个独立实验)。
图2
图2。Hsp70抑制全长和截短α-Syn蛋白的原纤维组装
一个,这显示了本研究中使用的各种α-Syn结构。全长即WTα-Syn具有一个中央疏水结构域(NAC),与伴侣介导的自噬(CMA)的假定识别基序相邻。B类将纯化的WT、C末端截断(1-130、1-120、1-110)或N末端截断(21-140)α-Syn(72μM)在存在Hsp70(7.2μM)的384孔板中培养96h。对照反应中含有7.2μM BSA代替Hsp70。缺失原纤维组装所需NAC区域(Δ71-82)的突变体α-Syn被纳入非组装阴性对照。ThT读数显示,Hsp70抑制所有受试物种的纤维形成,这表明α-Syn的极端C和N端对伴侣介导的抑制不需要(数据表示为两个独立实验的平均值±标准差),n个= 4).C、 D类在含有Hsp70(+)或BSA(-)的微滤管中进行含有各种α-Syn(72μM)的纤维组装反应。48-96小时后,以100000×g离心反应,并用15%SDS-PAGE分离。考马斯蓝染色显示蛋白质(s:上清液;p:颗粒)。
图3
图3。Hsp70通过α-Syn的NAC结构域抑制原纤维组装
一个α-Syn的ThT测量Δ95-99培养96小时后,在BSA或Hsp70存在下的组装反应(72μM)。B类离心后考马斯蓝显示可溶性(s)和粒化(p)α-Syn,显示Hsp70抑制聚集。C类,α-Syn的ThT荧光1-89(72μM)反应。以7.2μM(1:10)或36μM(1:2)的初始浓度添加伴侣或BSA。D类24小时后的反应沉淀表明,大多数α-Syn1至89在这段时间内,在BSA的存在下聚集,而当Hsp70在高浓度(1:2)下存在时,溶解度保持不变。E类,在存在Hsp70或BSA(1:2)的情况下,NAC肽组合(80μM)的ThT测量。孵育开始后20小时读取读数。与其他α-Syn物种类似,Hsp70的添加导致ThT荧光显著降低,表明淀粉样纤维的组装减少,沉淀后用NAC-1进行的western blotting证实了这一点(F类)显示对照样品中堆积在堆垛机(Stk)中的聚集NAC,而经Hsp70处理的NAC出现在分离凝胶(Res)中。EM显示在BSA存在下形成的负染NAC纤维(G公司)以及添加Hsp70时的非晶聚集体(H(H)). 比例尺=100nm。
图4
图4。Hsp70存在下α-Syn的EM表征
含有全长α-Syn(72μM)的纤维组装反应在7.2μM BSA存在下培养96小时(一个)或Hsp70(B类). 还包括仅含有Hsp70的反应(C类). 将每个反应的3μL吸附在碳/甲醛涂层网格上,并在1%乙酸铀酰负染后通过透射电镜观察。与直径为10-14 nm的均匀纤维相比,添加Hsp70会产生20-50 nm范围内的无定形物体和更大的聚集物。使用针对Hsp70(3a3,黑箭头)和α-Syn(SNL-1,白箭头)的抗体对含有Hsp70的α-Syn-组装反应样品进行免疫染色。抗Hsp70抗体的单标记显示无定形聚集体的强染色(D类). 相反,双重标记并未显示抗α-Syn与聚集体或Hsp70的共定位(E、 F、G). 比例尺:500nm(A、 B、C类);100纳米(D、 电子);50纳米(F、 G公司).H(H)、Hsp70、GST-Hsp70386-640,或BSA在不存在α-Syn的情况下搅拌孵育72小时,并在离心(100000×g)后通过SDS-PAGE分离。蛋白质的考马斯蓝染色表明,仅Hsp70及其底物结合就能够形成颗粒聚集体。
图5
图5:。监测α-Syn对Hsp70的抑制488FP组装
在添加Hsp70或BSA(7.2μM)后的不同时间点,通过测量样品中的FP来监测含有标记全长(72μM)的反应。含有BSA的对照反应显示,对应于α-合成纤维的FP大幅增加。然而,在反应开始时添加Hsp70仅导致FP在20-24h时略有增加,此后保持不变,这可能反映了少量α-Syn:Hsp70络合物的形成。
图6
图6。Hsp70与α-Syn的可逆相互作用
一个,抑制反应中α-Syn的免疫沉淀。使用Syn211抗体孵育后0、24和72小时,从含有Hsp70的反应中免疫沉淀5μgα-Syn。用SDS-PAGE分离总输入量(T)、流经量(F)和免疫沉淀物(IP),分别占各部分的20%、10%和40%,并对Hsp70(3a3)或α-Syn(Syn303)进行免疫印迹。B类,α-Syn示意图594置换分析。含有标记的α-Syn(α-Syn-)的组装反应594)以亚化学计量量(1:10)的伴侣或GST作为对照抑制。培养72小时后,等量新鲜单体α-Syn488添加到每个反应中。通过测量α-Syn的相对荧光来评估聚集594和α-Syn488在100000×g离心后的可溶部分中,含有GST的反应(C类)或GST-Hsp70386-640(D类)在α-Syn后24或48小时立即监测488已添加。黑色和灰色线条表示可溶性α-Syn594和α-Syn488分别是。α-Syn的比例相似594和α-Syn488在延长孵育后的可溶性部分中发现,表明先前结合的α–Syn594易于替换。数据表示4个独立反应±标准偏差的平均值。
图7
图7。经Hsp70处理的α-Syn保持其组装能力
在含有GST-Hsp70的组装反应中测量ThT荧光386-640以及那些陪护已经耗尽的人。在引发72小时后,使用谷胱甘肽树脂消除反应。与使用Hsp70的反应(ThT荧光保持不变)不同,在Hsp70缺失的反应中,ThT在滞后期后增加,类似于在幼稚反应中看到的滞后期。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差。

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