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.2008年12月；28(23):7066-80.
doi:10.128/MCB.00244-08。 Epub 2008年9月22日。

人AP-endonuclease（APE1/Ref-1）在YB-1介导的多药耐药基因MDR1激活中的调节作用

Ranajoy Chattopadhyay公司 1, 索米塔·达斯, 阿米特·卡梅蒂, 伊斯特万·博尔多夫, 谢敬武, 塔帕斯·K·哈兹拉, Kimitoshi Kohno公司, 桑卡·米特拉, 基肖尔·巴卡特
附属公司

人AP核酸内切酶（APE1/Ref-1）在YB-1介导的多药耐药基因MDR1激活中的调节作用

Ranajoy Chattopadhyay公司等人。 分子细胞生物学. 2008年12月.

摘要

人AP核酸内切酶（APE1/Ref-1）是一种参与修复氧化性碱基损伤和DNA链断裂的中心酶，作为与几种反式作用因子结合的转录调节因子具有第二种活性。APE1过表达常见于肿瘤细胞，并对多种抗癌药物产生耐药性；它的下调使肿瘤细胞对这些药物敏感。由于APE1参与修复这些药物诱导的DNA损伤的可能性不大，因此耐药可能与APE1的转录调控功能有关。在这里，我们表明APE1最好以乙酰化形式与Y盒结合蛋白1（YB-1）稳定相互作用，并增强其与Y盒元件的结合，从而激活多药耐药基因MDR1。野生型APE1的异位表达而非其非乙酰化突变体的异位表达导致MDR1水平的提高，强调了APE1乙酰化在其辅激活子功能中的重要性。APE1下调使MDR1过度表达的肿瘤细胞对顺铂或阿霉素敏感，表明APE1在YB-1介导的基因表达中起着关键作用，从而在肿瘤细胞中产生耐药性。在非小细胞肺癌组织样本中观察到APE1和MDR1表达系统性增加。因此，我们的研究确立了APE1乙酰化介导的转录调控功能的新作用，使其成为肿瘤细胞药物敏化的潜在靶点。

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数字

图1。
图1。
YB-1和APE1之间的稳定相互作用。（A） YB-1作为APE1相关蛋白的鉴定。转染FLAG标记的APE1或空载体的HCT116细胞的提取物用FLAG抗体免疫沉淀，结合蛋白用FLAG肽洗脱，SDS-PAGE解析，考马斯染色观察。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间分析鉴定YB-1和MVP（箭头标记）。（B，顶部）转染空载体或WT APE1-FLAG或NΔ33APE1-FLA的HCT116细胞提取物用FLAG抗体免疫沉淀，用YB-1抗体进行Western分析。（下图）用FLAG抗体对相同的印迹进行西方分析。（C） 用APE1抗体（顶部）或FLAG抗体（底部）对FLAG-YB-1免疫沉淀物进行西方分析。（D） 使用WT或NΔ33APE1（左）、GST标记的APE1的N端69个氨基酸残基（中）和未修饰的APE或AcAPE1进行YB-1抗体的Far-Western分析（右）。对照组为牛血清白蛋白（BSA）。（E） GST-标记的YB-1分别与未修饰的APE1（第3通道）或体外乙酰化APE1培养（第5通道）。结合蛋白洗脱并用APE1抗体进行免疫印迹。（下图）用YB-1抗体对同一印迹进行西方分析。
图2。
图2。
通过远西方和GST下拉分析绘制YB-1中APE1相互作用区。（A） GST-YB1缺失突变体的示意图。CSD，冷激波域。（B） 远西分析。（右）APE1抗体用于测试不同的GST-YB-1缺失突变体。（左）YB-1缺失突变体的考马斯染色。（C） GST下拉分析。重组APE1与含有不同GST-YB-1缺失突变体（Δ6至Δ9，如图所示）的谷胱甘肽-淀粉亲和珠培养，洗脱的蛋白用APE1抗体进行免疫印迹。（D） YB-1对APE1的AP-核酸酶活性的影响。APE1（50 pM）与含有四氢呋喃的32如前所述（7），在YB-1（0.05至5 nM）含量增加的情况下，P标记双链，并在20%脲聚丙烯酰胺凝胶中分析反应产物。S、 基质；P、 产品。
图3。
图3。
APE1增强了YB-1与Y盒序列的结合。（A） YB-1（10 ng）的EMSA，添加或不添加APE1（20 ng）或AcAPE132含有WT Y-box序列的P标记双链寡核苷酸。车道5和6、APE1或AcAPE1单独。（B） APE1增强HCT116 NE与5′的结合32P标记的含Y盒的寡核苷酸（oligo）。通道1，自由探头。通道2至16，EMSA仅含NE（3μg）或存在50倍未标记WT或突变寡核苷酸（通道2至4）；NE与抗YB-1、抗APE1和对照兔IgG预孵育（5-7道）；来自APE1 siRNA-处理细胞的NE单独或补充100 ng或500 ng重组APE1（通道8至10）；和NE来自表达异位APE1的细胞（第13道）或单独经APE1 siRNA处理的细胞（右侧，第14道）或补充500 ng APE1（第15道）或重组AcAPE1细胞（第16道）。（C） 用YB-1（顶部）或APE1（底部）抗体对与5′生物素标记的WT或突变的Y盒寡核苷酸结合的洗脱蛋白进行Western分析。（D） HCT116细胞与MDR1启动子驱动的荧光素酶报告质粒共转染，该报告质粒包含WT（灰色）或突变（黑色）Y盒以及APE1表达质粒（WT或K6R/K7R突变）或等量的空载体。如有指示，在报告质粒转染前24小时，用APE1特异性siRNA或对照siRNA（80 nM）转染细胞。荧光素酶活性用共表达的β-半乳糖苷酶标准化。条形图显示了重复进行的三个独立实验的平均值±标准偏差。（E） 重组AcAPE1和HCT116细胞提取物与AcAPE1-特异性抗体的Western分析。（F） 用FLAG-YB-1转染HCT116细胞，24 h后用TSA（100 ng/ml）处理12 h。用AcAPE1（顶部）或FLAG抗体（底部）进行Western blotting分析带有FLAG抗体的细胞提取物的免疫沉淀物。
图4。
图4。
顺铂治疗后APE1和YB-1之间的相互作用增强。（A） 用APE1-FLAG转染的HCT116细胞用40μg/ml顺铂处理12小时（泳道2和5）和36小时（泳道3和6）。使用FLAG抗体珠免疫沉淀NE，然后使用YB-1抗体（右上）或FLAG抗体（右下）进行Western分析。（左）输入核提取物中YB-1的西方分析（层粘连蛋白B作为负荷控制）。（B） 顺铂治疗12小时后，对核（左）和全细胞（右）提取物中的APE1、AcAPE1和MDR1进行Western分析。将层粘连蛋白B（左下）或α-微管蛋白（右下）用作负荷对照。（C） 顺铂治疗后APE1和YB-1的共定位。HCT116细胞用兔YB-1（i和v）和小鼠APE1抗体（iii和vi）进行免疫染色，然后用山羊抗兔Texas Red-labeled和山羊抗鼠荧光素异硫氰酸标记二级抗体进行免疫染色。vii，图像v和vi.DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）用于核染色（ii和iv）。
图5：。
图5：。
APE1乙酰化依赖性MDR1表达增强。（A） 用WT（第2和第4道）或K6R/K7R（第3和第5道）APE1表达质粒转染A2780/100细胞。24小时后，用100 ng/ml TSA（第4和第5道）处理一组细胞12小时，用MDR1抗体进行Western blotting分析MDR1水平。（B，顶部）转染FLAG标记的WT APE1或K6R/K7R APE1的HCT116和A2780/100细胞的提取物用FLAG抗体珠免疫沉淀，并用YB-1抗体进行Western blotting分析。（下图）用FLAG抗体对相同的印迹进行西方分析。（C） APE1与MDR1启动子体内关联的ChIP分析。免疫沉淀MDR1启动子序列的PCR分析。泳道1，DNA分子量标记；通道2至5，MDR1启动子序列分别位于对照IgG、未处理对照和顺铂和TSA处理的输入染色质中；通道7至9，免疫沉淀MDR1启动子序列，分别带有来自对照组和顺铂和TSA处理的细胞提取物的APE1抗体；通道6，免疫沉淀MDR1启动子和对照IgG。（底部）通过实时PCR分析定量免疫沉淀MDR1启动子DNA，如材料和方法中所述。（D） 用80 nM APE1 siRNA寡核苷酸转染HCT116和A2780/100细胞。转染后48小时通过Western分析测定MDR1水平（顶部）（α-微管蛋白用作负荷对照）。
图6。
图6。
APE1下调使耐药细胞敏感。（A） A2780/100（左）和MCF-7 APE1 mRNA的实时RT-PCR分析MDR1型（右）细胞转染80 nM APE1特异性或对照双重siRNA后48 h。（B，左）APE1（顶部）或α-微管蛋白（底部）抗体的细胞提取物的蛋白质分析。（右）MCF-7中MDR1水平的西方分析MDR1型用80 nM APE1 siRNA寡核苷酸转染48 h后的细胞。A2780/100和MCF-7的（C和D）存活试验MDR1型用任一对照转染的细胞(▪) 或APE1（•）siRNA；转染48小时后，将～300个细胞置于60-mm培养皿中，并用浓度增加的顺铂（0-200μM）或阿霉素（0-300nM）处理。在药物治疗或不药物治疗的情况下将细胞保存10天，并使用结晶紫对菌落进行计数。100%对应于未经药物治疗的对照组中的菌落数。材料和方法中给出了其他详细信息。
图7。
图7。
MDR1表达与正常肺和非小细胞肺癌组织中APE1水平相关。（A） 不同肺癌细胞系细胞提取物中APE1、AcAPE1和MDR1水平的西方分析。以α-管蛋白为负荷对照。（B） 材料和方法中描述的15例非小细胞肺癌标本和近端正常肺组织APE1和MDR1 mRNA表达水平的实时RT-PCR分析。APE1 mRNA的表达水平相对于患者1n的正常肺组织中的水平，该水平被标准化为1。n、 正常肺组织；c、 非小细胞肺癌组织。条形图显示了重复进行的三个独立实验的平均值±标准偏差。（C） 正常和非小细胞肺癌样本中APE1和MDR1表达水平的相关性（左）(第页= 0.581;对=0.0005）和非小细胞肺癌样本（右）(第页= 0.558;对= 0.03).
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