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.2008年11月；28(22):6954-66.
doi:10.1128/MCB.00925-08。 Epub 2008年9月15日。

胞外信号调节激酶2（ERK2）磷酸化位点和核孔复合体蛋白Tpr上的对接域协同调节ERK2-Tpr相互作用

托马斯·沃马斯泰克 1, 马钦·皮瓦尼基, Richard Burack女士, 迪维亚·蒂瓦里, 德瓦南·库马尔, J托马斯·帕森斯, 迈克尔·J·韦伯, 维奈·库马尔·南迪科里
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胞外信号调节激酶2（ERK2）磷酸化位点和核孔复合体蛋白Tpr上的对接域协同调节ERK2-Tpr相互作用

托马斯·沃马斯泰克等。 分子细胞生物学. 2008年11月.

摘要

鉴定有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的直接底物并了解这些底物是如何被选择的，对于理解这些普遍活化的酶如何产生不同的生物反应至关重要。在之前的工作中，我们确定了MAPK ERK2（细胞外信号调节激酶2）的几个新候选底物，包括核孔复合体蛋白Tpr（易位启动子区）。在本报告中，我们确定了Tpr上ERK2磷酸化和结合的位点，并证明了它们的功能相互作用。ERK2磷酸化和二聚化是ERK2-Tpr结合所必需的，这通过Tpr上的DEF（ERK2，FXF的对接位点）域发生。令人惊讶的是，与磷酸化减少结合的底物相比，DEF结构域和磷酸化位点显示出促进ERK2与Tpr结合的正协同作用。Tpr的异位表达或缺失导致激活的ERK2从细胞质到细胞核的移动减少，这意味着Tpr在ERK2易位中发挥作用。总的来说，这些数据提供了直接证据，证明核孔复合体的一个成分是体内ERK2的真正底物，活化的ERK2在磷酸化后与该底物稳定结合，在核孔功能中发挥持续作用。我们认为Tpr是激活ERK的底物和支架。

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数字

图1。
图1。
Tpr的羧基末端足以在EGF刺激时与ERK2结合。（A） 将转染pcDNA3、FLAG-ERK2和FLAG-ERK1-QG的细胞进行血清饥饿处理4至5 h，然后用EGF（20 ng/ml）刺激10 min。用FLAG-M2琼脂糖珠溶解细胞并免疫沉淀蛋白质（IP）。免疫沉淀蛋白用10%SDS-PAGE溶解，然后用抗FLAG-M2或抗Tpr抗体进行免疫印迹。（B） 转染pcDNA3、HA-TprC、FLAG-ERK2或FLAG-ERK 2和HA-TprC-的细胞被血清饥饿，并被EGF刺激。如图A所述，对蛋白质进行免疫沉淀并通过免疫印迹进行分析，并用抗FLAG-M2和抗HA抗体进行探测。（C） 与B组一样，除了用与蛋白A琼脂糖偶联的抗HA抗体免疫沉淀蛋白质，然后用抗FLAG-M2和抗HA抗体进行免疫印迹。
图2。
图2。
Tpr不与MEK1、JNK1或p38α相互作用。（A） 转染pcDNA3、FLAG-ERK2、FLAG-ERK2-QG、FLAG-ERK1和FLAG-MEK1的细胞被血清饥饿，并被EGF刺激。用FLAG-M2琼脂糖珠溶解细胞和蛋白质免疫沉淀（IP），然后用抗Tpr和抗FLAG-M2-抗体进行免疫印迹。（B） 用pcDNA3或HA-TprC转染细胞，或用HA-TprC+FLAG-ERK2或FLAG-JNK1或FLAG-p38α双重转染细胞。最后两组用茴香霉素代替EGF刺激30分钟。用抗FLAG-M2和抗HA抗体探测细胞裂解物。基于这些结果，与其他转染细胞的数量相比，用于从共同转染FLAG-JNK1和HA-TprC的细胞中进行免疫沉淀的裂解物的数量是前者的两倍。用FLAG-M2琼脂糖珠免疫沉淀蛋白质。通过使用抗FLAG-M2、抗磷-ERK2（Sigma）、抗磷-JNK1（Sigma-）和抗磷-p38α（Sigma-）探针分析二十分之一的免疫沉淀蛋白。用抗HA抗体检测其余免疫沉淀蛋白。
图3。
图3。
ERK2在体外磷酸化Tpr的丝氨酸和苏氨酸残基。（A） 分别用FLAG-ERK2、FLAG-TprC和pcDNA3载体转染细胞。细胞被血清饥饿，转染FLAG-ERK2的细胞被EGF刺激。用FLAG-M2琼脂糖珠从裂解细胞中免疫沉淀蛋白质，并将FLAG-ERK2免疫沉淀与FLAG-TprC免疫沉淀或pcDNA3转染细胞的免疫沉淀混合。用[γ]进行激酶反应-32P] ATP在30°C下保持10分钟。（B）根据时间进程反应对体外标记的TprC进行磷氨基酸分析。p、 磷酸化。（C） 体外磷酸化的TprC用胰蛋白酶消化，所得磷酸肽通过二维TLC绘制（4）。两个主要点用白色箭头表示，四个次要点用黑色箭头表示。
图4。
图4。
Tpr在四个不同的位点被ERK2磷酸化。（A） 用FLAG-TprFL、FLAG-TprC和FLAG-TprC突变体转染COS-1细胞（如上图所示）。将免疫沉淀的FLAG标记的Tpr蛋白与免疫沉淀的FLAG-ERK2混合，并与[γ-32P] ATP。用胰蛋白酶消化体外磷酸化的FLAG标记的TprFL、TprC和TprC突变体，并通过TLC上的二维分离绘制得到的磷酸肽。TprFL和TprC地图中类似位置的点由编号的黑色箭头指示。由于TprC磷酸化位点突变而缺失的斑点由编号的白色箭头指示。（B） 上部面板描述了TprC的组合靶位点突变体的命名。假定的D域(2091右后QSVGRG公司我问我2101)和DEF图案(2150F类对F类2152)也用粗体表示（与每个图案的一致性相匹配的残基）。在玻璃体中，用胰蛋白酶消化磷酸化蛋白，并通过TLC（4）绘制生成的磷酸肽。TprC中的主要（点3、4和4*）和次要（点1和2）点由编号的黑色箭头指示。TprCM2、TprC16M3和TprC12M3中的缺失点由编号的白色箭头指示。在TprC-M4中，缺失点的位置用虚线圈出。（C） 成立32在三个独立的实验中，通过切伦科夫计数对体外磷酸化TprC、TprC-M4和病媒对照样品中的P进行定量。每次实验中，TprC中的计数均归一化为100%，其他样本中的计数百分比根据TprC进行计算。结果以TprC的百分比计数绘制在年轴和上的样本x个轴。
图5：。
图5：。
ERK2在体内和体外的相同位点磷酸化Tpr。（A） 用FLAG-TprFL或FLAG-TprC载体转染COS-1细胞。转基因细胞经代谢标记3 h。对于EGF刺激的样品，在3 h后将EGF（20 ng/ml）添加到标记细胞中10 min。对于MEK抑制剂UO126的样品，3 h标记和EGF刺激期间存在20μM抑制剂。FLAG标记的TprFL和TprC进行免疫沉淀、溶解、转移和放射自显影。用胰蛋白酶消化体内标记的TprFL和TprC，并通过二维TLC绘制生成的磷酸肽。早期实验中的经玻璃体标记的TprC与经活体标记的T prC和T prFL一起在TLC板上解析。在EGF刺激后显示强度略有增加的肽点用白色箭头表示（图2）。UO126预处理后未消失的斑点在第一个面板上用虚线标记。（B） 如上所述，用EGF刺激对FLAG-TprC-和FLAG-TprC-M4转染细胞进行代谢标记。通过二维TLC解析色氨酸消化肽（4）。
图6。
图6。
Tpr-ERK2相互作用需要ERK2磷酸化和二聚化，但不需要D结构域。（A） 转染pcDNA3、FLAG-ERK2和FLAG-ERK1-TAYF突变体的细胞被血清饥饿，并被EGF刺激。用来自裂解细胞的FLAG-M2琼脂糖珠免疫沉淀（IP）的蛋白质进行免疫印迹，并用抗FLAG和抗Tpr抗体探测。（B） 转染pcDNA3、FLAG-ERK2和FLAG-ERK1-Δ4二聚体突变体的细胞受到血清饥饿和EGF刺激。用FLAG-M2琼脂糖珠免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹，并用抗FLAG和抗Tpr抗体进行检测。（C） 转染pcDNA3、FLAG-ERK2和FLAG-ERK1-DD的COS-1细胞→NN被血清饥饿，然后像往常一样用EGF刺激。用α-FLAG-M2琼脂糖珠从裂解细胞免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹，并用抗FLAG和抗MEK1小鼠单克隆抗体（转导实验室）、抗Rsk1山羊多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.）和抗Tpr抗体探测裂解物和免疫沉淀物。
图7。
图7。
ERK2通过DEF和磷酸化位点与Tpr相互作用。（A） 用FLAG-ERK2或FLAG-ERK2-DD共转染细胞→NN或FLAG-ERK2 L232A或pcDNA3和HA-TprC。在血清饥饿和EGF刺激后，用抗FLAG抗体免疫沉淀蛋白质（IP）。用抗FLAG和抗HA抗体检测裂解产物和免疫沉淀蛋白。免疫沉淀物也用α-磷酸-ERK抗体进行检测。（B） 用FLAG-TprC或HA-ERK2转染细胞，或用FLAG-T prC或FLAG-TprC-FXF双重转染细胞→AXA、FLAG-TprC-M4或FLAG-TprC-FXF→AXA、M4或FLAG-TprC-Δ60和HA-ERK2。在血清饥饿和EGF刺激后，用抗HA抗体免疫沉淀蛋白质。用抗FLAG、抗HA和抗磷酸-ERK抗体探测裂解液和免疫沉淀蛋白。（C） 使用Image J软件（Wayne Rasband，美国国立卫生研究院），使用X射线胶片线性范围内的适当增强化学发光照射来定量免疫沉淀的野生型和Tpr突变体。显示EGF的存在（+）或不存在（−）以及样本名称。TprC+EGF样本的值设置为100%。在每次实验中，计算剩余样品的TprC+EGF结合百分比值。三个独立实验的结合百分比值用于计算标准偏差。
图8。
图8。
Tpr磷酸化增强ERK2-Tpr结合。（A） 用pcDNA3或HA-ERK2或HA-ER1-K52R和FLAG-TprC或FLAG-TprC-FXF共同转染细胞→安盛航空。在血清饥饿和EGF刺激后，用抗HA珠（Sigma）免疫沉淀蛋白质（IP）。用抗FLAG和抗HA抗体检测裂解产物和免疫沉淀蛋白。
图9：。
图9：。
ERK2磷酸化与Tpr相互作用的蛋白质。（A） COS-1细胞与FLAG-TprFL或FLAG-TprFL-FXF共转染→AXA、M4和HA-ERK2或HA-ERK1-QG。细胞被血清饥饿并用20ng/ml EGF刺激，并且用FLAG-M2琼脂糖珠免疫沉淀（IP）蛋白质。用1/10的免疫沉淀蛋白进行体外激酶反应，用SDS-PAGE溶解部分裂解产物，转移到硝化纤维素膜上，并用抗FLAG和抗HA抗体进行探测。（B） 通过使用～20μCi[γ-32P] cpATP（模拟ATP）作为底物在30°C下保持15分钟。这些反应混合物体积的1/5通过SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素膜上，并进行自动射线照相。（C） 激酶反应混合物的剩余部分在pH为4至7的二维凝胶上溶解，如我们之前的报告（10）所述。白色箭头所示的背景斑点用于对齐放射自显影。在TprFL+ERK2-QG反应（中间面板）中专门检测到的其他斑点用黑色箭头表示。
图10。
图10。
Tpr调节YFP-ERK对EGF刺激的核内招募。将表达CFP-MEK和YFP-ERK的对照或Tpr-siRNA处理的HEK293T细胞镀在涂有细胞外基质成分（10μg/ml纤维连接蛋白和5μg/ml IV型胶原）的玻璃皿上。第二天，剥夺细胞血清3小时，用EGF（10 ng/ml）刺激细胞。（A） 对照细胞和Tpr-siRNA-处理细胞中Tpr表达的Western blot分析。用材料和方法中描述的抗Tpr和抗疟原虫抗体探测来自对照细胞和Tpr敲除细胞的裂解液。（B） EGF刺激前后对照组和Tpr-siRNA-处理的HEK293T细胞中YFP-ERK核定位的图像和量化。（C） 图像显示了EGF刺激前后pcDNA3-或Flag-Tpr表达细胞中YFP-ERK的定量，以及对pcDNA3和Flag-Tpr表达细胞的Flag-Trp表达的Western blot分析。在B组和C组中，每个实验条件下约有50到70个细胞用于量化YFP-ERK向细胞核的移位。每个实验重复两次。
图11：。
图11：。
GFP-Tpr和GFP-Tpr-M4的本地化。图像显示了转染GFP-Tpr或GFP-Tpr-M4的COS-1细胞的共焦显微镜（如材料和方法中所述）。
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