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.2008年11月1日；232(3):408-17.
doi:10.1016/j.taap.2008.08.007。 Epub 2008年8月15日。

细胞外信号调节激酶1/2和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-3的相互调节

尼古莱特·泽利亚特 1, 劳拉·J·毛罗, 伊丽莎白·沃滕贝格
附属公司

细胞外信号调节激酶1/2和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-3的相互调节

尼古莱特·泽利亚特等。 毒理学应用药理学. .

摘要

有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶-3（MKP-3）是一种公认的肿瘤抑制因子。当短暂过度表达时，MKP-3使细胞外信号调节激酶（ERK）1/2去磷酸化并失活。然而，对内源性MKP-3的作用知之甚少。我们之前发现MKP-3在表达致癌Ras的细胞系中上调。在这里，我们测试了内源性MKP-3在通过表达致癌Ras慢性刺激Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2通路的条件下调节ERK1/2的作用。我们使用了两种细胞系：H-ras MCF10A（表达H-ras的乳腺上皮细胞）和DLD-1（表达内源性Ki-ras的结肠癌细胞）。首先，我们发现当致癌Ras刺激Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2级联反应时，MKP-3在负反馈回路中发挥作用，抑制基础ERK1/2。要求ERK1/2维持升高的MKP-3，这表明存在负反馈回路。因此，通过siRNA敲低MKP-3，增加ERK1/2磷酸化。其次，通过使用siRNA，我们发现MKP-3通过限制ERK1/2磷酸化的持续时间，帮助建立ERK1/2对细胞外活化剂的敏感性。第三，我们发现MKP-3对ERK1/2的调节被ERK1/2对MKP-3的复杂调节所抵消。由于ERK1/2依赖性降低MKP-3蛋白的稳定性，有效的ERK1/2激活剂在30分钟内刺激了MKP-3的丢失。由于ERK1/2依赖性再合成，MKP-3水平在120分钟内恢复。通过siRNA阻止MKP-3再合成，延长ERK1/2磷酸化。总之，这些结果表明，在致癌Ras表达的压力下，MKP-3通过服务于ERK1/2依赖性负反馈通路而重新控制ERK1/2。

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数字

图1
图1
通过siRNA敲低MKP-3增加H细胞ERK1/2磷酸化-ras（拉斯维加斯）MCF10A和DLD-1细胞。（A） 从血清饥饿的MCF10A和H制备全细胞裂解物-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞。MKP-3型(顶部面板)免疫印迹检测。剥离并重制β-微管蛋白的印迹(底部面板)作为加载控件。全细胞裂解物由（B）H制备-ras（拉斯维加斯）未转染的MCF10A细胞或（C）DLD-1细胞（通道1），转染了靶向MKP-3的双链siRNA（通道2），或转染了双链干扰siRNA（路径3）。免疫印迹分析检测到以下蛋白：双磷酸化活性MEK1/2（pMEK1/2）；总MEK1；双磷酸化活性ERK1/2（pERK1/2）；总ERK2；或MKP-3。去除MKP-3印迹，并重新进行β-微管蛋白的印迹，作为负荷对照。作为磷酸化-MEK1/2的阳性对照，未转染细胞用（B）1.6 nM TPA（第4通道）培养120分钟，或用（C）3 nM EGF（第4车道）培养30分钟。我们和其他人已经观察到，MKP-3通常以双峰运行（Muda等人，1996；Camps等人，1998；Reffas和Schlegel，2000；Warmka等人，2004）。这些图表示（B）10个独立实验和（C）6个独立实验相对于未转染对照的平均pERK1/2密度测定；误差条代表SEM。填充条（nt），未转染。开放条（M），转染靶向MKP-3的双链siRNA。孵化条（S），转染双链干扰siRNA。H-ras（拉斯维加斯）与未转染对照组或干扰siRNA（H-ras（拉斯维加斯）MCF10A：第页=0.006，n=30，单因素方差分析和Tukey's HSD，α=0.05；DLD-1：第页=0.0008，n=18，单因素方差分析和Tukey's HSD，α=0.05）。我们没有检测到非转染细胞和用干扰siRNA转染的细胞之间的差异。
图2
图2
ERK1/2是维持MKP-3 RNA和蛋白质水平升高所必需的。（A） 全细胞裂解物由H-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞在不存在的情况下培养60分钟(−)或存在（+）3μM U0126。双磷酸化的活性ERK1/2（pERK1/2，顶部面板)或总ERK2(底部面板)免疫印迹法检测。（B） 从H中提取总RNA-ras（拉斯维加斯）在没有（−）或存在（+）3μM U0126的情况下培养60分钟的MCF10A细胞。MKP-3型(顶部面板)和GAPDH(底部面板)通过RT-PCR监测RNA水平。（C） H（H）-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞在不存在的情况下培养8小时(−)或存在（+），共3个μM U0126号机组。MKP-3蛋白水平(顶部面板)通过免疫印迹分析监测全细胞裂解液中的β-微管蛋白(底部面板)作为加载控件。所示数据代表了至少三个独立实验。
图3
图3
TPA和EGF刺激MKP-3蛋白的丢失和恢复。全细胞裂解物由（A）H制备-ras（拉斯维加斯）用1.6 nM TPA培养指定时间的MCF10A细胞；（B） H（H）-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞；或（C）使用3 nM EGF培养指定时间的DLD-1细胞。免疫印迹分析检测到以下蛋白：双磷酸化活性MEK1/2（pMEK1/2）；总MEK1；双磷酸化活性ERK1/2（pERK1/2）；总ERK2；或MKP-3。去除MKP-3印迹，并重新进行β-微管蛋白的印迹，作为负荷对照。这些图表表示3个独立实验的pMEK1/2、pERK1/2和MKP-3的平均密度测定；误差条代表SEM。填充条，pMEK1/2。开杆，pERK1/2。阴影条，MKP-3。
图4
图4
TPA通过ERK1/2依赖性途径刺激H中MKP-3蛋白稳定性的降低-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞。（A） H（H）-ras（拉斯维加斯）将MCF10A细胞与1.6 nM TPA孵育指定时间。提取总RNA和MKP-3 RNA水平(顶部面板)和GAPDH RNA(底部面板)通过RT-PCR监测。（B） 该图表示三个独立实验中MKP-3 RNA相对于未处理对照的平均密度测定；误差条代表SEM。（C） H（H）-ras（拉斯维加斯）将MCF10A细胞与36μM环己酰亚胺孵育指定时间(瑞士法郎)单独或存在1.6 nM TPA(CHX+TPA). （D） H（H）-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞在3μM U0126存在下与环己酰亚胺孵育指定时间(CHX+U（瑞士法郎）)，或U0126和TPA一起(CHX+U+TPA).（C） （D）免疫印迹分析检测到以下蛋白：双磷酸化活性ERK1/2（pERK1/2）；总ERK2；MKP-3。去除MKP-3印迹，并重新进行β-微管蛋白的印迹，作为负荷对照。（E） 该图表示来自三个独立实验的平均MKP-3密度测定；误差条代表SEM。单用环己酰亚胺(开放式广场). 环己酰亚胺+TPA(填充的正方形). 环己酰亚胺加U0126(开放的圆圈). 环己酰亚胺加U0126和TPA(实心圆圈).与对照细胞相比，用TPA孵育细胞导致MKP3蛋白的下降更快；所有其他治疗组之间没有可检测的差异（双向方差分析，n=48，时间和治疗的主要影响均显著(第页<0.0014).
图5
图5
TPA刺激H中MKP-3 RNA的ERK1/2依赖性增加-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞。（A） 小时-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞在不含（−）或含（+）1.6 nM TPA和6μM放线菌素D的情况下孵育指定时间。通过免疫印迹监测全细胞裂解物中MKP-3蛋白水平(顶部面板). 剥离并重制β-微管蛋白的印迹(底部面板)作为加载控件。（B） 该图表示来自三个独立实验的平均MKP-3密度测定；误差条代表SEM。填充条，仅放线菌素D。开放酒吧，仅TPA。阴影条，放线菌素D加TPA。零点表示未处理的单元格。（C） H（H）-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞在没有（−）或（+）1.6 nM TPA和3μM U0126的情况下培养120分钟。免疫印迹分析检测到以下蛋白：双磷酸化活性ERK1/2（pERK1/2）；总ERK2；和MKP-3。去除MKP-3印迹，并重新进行β-微管蛋白的印迹，作为负荷对照。（D） H（H）-ras（拉斯维加斯）MCF10A细胞在没有（−）或（+）1.6 nM TPA和3μM U0126的情况下培养90分钟。提取总RNA和MKP-3 RNA水平(顶部面板)和GAPDH RNA(底部面板)通过RT-PCR监测。所示数据代表了至少三个独立实验。
图6
图6
通过siRNA敲低MKP-3延长EGF-和TNF-α刺激的DLD-1细胞ERK1/2磷酸化。DLD-1细胞未被转染(−)或转染（+）针对MKP-3（MKP-3）的双链siRNA或双链加扰siRNA（加扰）。然后用（A）3 nM EGF或（C）57 nM TNF培养细胞指定的时间-α. 用免疫印迹法分析全细胞裂解物中的蛋白质，以确定以下蛋白质：双磷酸化的活性ERK1/2（pERK1/2）；MKP-3；总ERK2；或β-微管蛋白。请注意，（A）中显示的面板代表两个不同的印迹，但两个印迹的零点使用了相同的裂解物。（B） 该图表示三个独立实验的平均pERK1/2密度测定；误差条代表SEM。用siRNA敲除MKP3延长EGF刺激的ERK1/2磷酸化升高；在未转染和扰乱的样本中，pERK1/2水平没有可检测的差异（双向方差分析，n=45，治疗和时间的主要影响在第页<0.001。使用Tukey的HSD评估治疗手段之间的差异，α=0.05）。填充条形图，未修改。开放条，转染靶向MKP-3的双链siRNA。用双重干扰siRNA转染的带阴影条。（D）该图表示四个独立实验中相对于未转染对照的平均pERK1/2密度测定；误差条代表SEM。用siRNA敲除MKP3延长TNFα刺激的ERK1/2磷酸化升高；未转染和打乱样品中pERK1/2的水平没有可检测的差异（双向方差分析，n=46，治疗的主要效果在第页<0.017. 使用Tukey的HSD（α=0.05）评估治疗方法之间的差异。填充条形图，未修改。填充条形图，未修改。开放条，转染靶向MKP-3的双链siRNA。孵化条，转染双链干扰siRNA。
图7
图7
ERK1/2和MKP-3的相互调节。ERK1/2的磷酸化和活化通常通过刺激Ras/Raf/MEK1/2蛋白激酶级联反应发生。GTPase Ras激活蛋白激酶Raf，Raf磷酸化并激活蛋白激酶MEK1/2。MEK1/2对磷酸化和激活ERK1/2具有高度特异性。ERK1/2活性的大小和持续时间取决于MEK1/2活性、磷酸化并激活ERK1/2的激酶和磷酸化并使ERK1/2失活的磷酸酶（如MKP-3）活性之间的平衡。抑制ERK1/2的MKP-3蛋白水平至少部分由ERK1/2调节。ERK1/2可以刺激MKP-3 RNA的表达增加。这导致MKP-3蛋白的增加，从而反馈和抑制ERK1/2的活性。然而，ERK1/2也可以刺激MKP-3蛋白稳定性的降低，从而导致MKP-3蛋白质的丢失。因此，MKP-3蛋白的水平至少部分取决于新MKP-3基因表达的刺激与MKP-3蛋白质稳定性之间的平衡。
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