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.2008年8月22日；283(34):23048-61.
doi:10.1074/jbc。M800032200。 Epub 2008年6月13日。

UDP-葡萄糖醛酸转移酶的主要化学脱毒系统需要蛋白激酶C支持的调节磷酸化

尼基尔·巴苏 1, 拉班亚莫伊·科尔, 穆苏米·巴苏, 库沙尔·查克拉波蒂, Partha S Mitra公司, 艾达·S·欧文斯
附属公司

UDP-葡萄糖醛酸转移酶的主要化学脱毒系统需要蛋白激酶C支持的调节磷酸化

尼基尔·巴苏等。 生物化学杂志. .

摘要

姜黄素治疗后发现LS180细胞中人类UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）的快速可逆下调导致发现UGTs需要磷酸化。UGTs主要分布于肝脏、肾脏和胃肠道，可灭活芳香类代谢物和大量饮食和环境化学品，从而降低毒性、诱变和致癌风险。我们的目的是确定相关激酶和调节LS180细胞和10种不同的人类UGT cDNA转染COS-1系统中组成性UGT磷酸化的机制。在用姜黄素或PKC抑制剂钙磷锡-C处理LS180细胞后，UGT和蛋白激酶Cepsilon（PKCepsilon）中可免疫检测的[（33）P]正磷酸盐的时间和浓度依赖性抑制表明UGT磷酸化由活性PKC支持。对UGT转染细胞的免疫荧光和联合免疫沉淀研究显示，UGT1A7His和PKCepsilon以及UGT1A10His和PKCalpha或PKCdelta共同定位。PKCepsilon特异性拮抗肽或PKCepsilin特异性小干扰RNA靶向破坏对UGT活性的抑制以及典型PKC激动剂激活姜黄素下调的UGT证实了PKC在葡萄糖醛酸化中的中心作用。此外，PKCepsilon对新生UGT1A7His的体外磷酸化证实它是一种真正的PKC底物。最后，过氧化氢酶或herbimycin-A对组成型或过氧化氢活化型UGT的抑制表明，活性氧类相关氧化剂在维持组成型PKC依赖性信号传导中充当第二信使，明显维持UGT磷酸化和活性。由于细胞共同使用信号转导来检测环境变化并对其作出适当反应，因此本报告结合我们之前的证明，即UGT1A7中的特定磷酸基团决定了底物选择，建议调节磷酸化使UGT能够适应不同的磷酸盐利用，从而有效发挥作用。

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数字

图1。
图1。
A类，人类UGT1A7或UGT1A10活动的时间进程表示为姜黄素和钙蛋白-C处理后的COS-1细胞，未经处理或用200μ米姜黄素或500 n米如图所示，采集钙磷蛋白C；对细胞提取物进行分析在里面体外如“实验程序”所述实验，按照“实验程序”重复三次，共三次；标准误差范围从±2到±5%。MTT试验在8小时后未显示毒性。B、 在体外UGT1A7和UGT1A10对姜黄素的葡萄糖醛酸化作用使用增加的浓度在COS-1细胞中表达。实验，进行重复“实验程序”中所述的一式三份；标准误差范围为±2%至±3%。
图2。
图2。
姜黄素或钙磷素-C处理UGT转染的COS-1细胞。用基于pSVL的UGT转染COS-1细胞72小时后，用姜黄素或钙蛋白-C；细胞匀浆和底物如图所示根据“实验程序”使用用抗UGT-CE进行Western blot分析（11） 根据“实验程序。”*，第页≤ 0.01; **,第页≤ 0.001.
图3。
图3。
姜黄素或钙蛋白C对LS180细胞UGT活性的抑制作用治疗。 A类姜黄素处理细胞的Western blot分析使用与葡萄糖醛酸化活性平行的UGT和PKCε抗体。姜黄素（50μg）提取物（25μg蛋白质）米)-处理或对照细胞在SDS 4–15%PAGE系统中分离。抗体朝向UGT-CE（52–55 kDa），PKCε的蛋白质骨架（92–96 kDa，或将磷丝氨酸-729-PKCε添加到单独的Western blot和按照“实验程序”进行处理面板4显示在体外对照组辣椒素的葡萄糖醛酸化值为1882±96 pmol/mg蛋白质/h。重复实验超过五倍。数据范围在±1和之间的标准误差±5%. **,第页≤ 0.001.B类,[33P] PKCε和UGT蛋白的正磷酸盐标记姜黄素对标记和UGT活性的平行抑制LS180细胞的治疗。所有细胞都暴露于[33P] 正磷酸盐（5 mCi/ml）8小时和50μ米用于0、1、3、5或8的姜黄素在“实验程序。”来自可溶性细胞提取物，免疫复合物反UGT-CE(面板4)和抗PKCε(面板2)是按照之前的“实验程序”进行清洗SDS-7.5%PAGE上的分辨率。此外，PKCε(面板1)和UGT(面板3)通过蛋白质印迹进行分析。处理过的凝胶暴露在外在x射线胶片上放置48小时。实验重复三次。UGT活动辣椒素的控制值为1857±74 pmol/mg蛋白质/h(面板5); 丁香酚生成了类似的曲线（数据没有如图所示）。C类钙磷蛋白C的浓度依赖性作用[33P] 正磷酸盐掺入LS180细胞的UGTs中。细胞允许将标签与钙磷蛋白C处理8小时之前“实验程序”中描述的最后一小时免疫复合和蛋白质印迹如下文所述C类(面板1–4)并测定UGT对辣椒素的活性(面板5). *,第页≤ 0.01; **,第页≤ 0.001.
图4。
图4。
PKCα与calnexin的共定位(A类)或钙网蛋白(B类)在对照COS-1细胞中。已为处理单元格共同免疫荧光，如“实验程序。”对于calnexin和PKCα的共定位用驴抗兔FITC偶联物进行可视化，PKCα用驴抗鼠TRITC共轭物可视化。荧光装配图像(面板1和2)表示熔合产生黄色的免疫荧光(面板4)在原子核外(面板5). 对于钙网蛋白和PKCα的共同定位，用驴抗兔FITC偶联物检测钙网织蛋白用驴抗鼠TRITC偶联物检测PKCα。组装荧光图像(面板1和2)表示熔合生成的黄色的免疫荧光(面板4)外部原子核(面板5). PKCα或PKCδ的共定标UGT1A10His在COS1细胞中表达。通过以下方法确定钴的比例驴抗兔FITC结合物探测UGT1A10的免疫荧光和PKCα与驴抗鼠TRITC结合物，如下所述“实验程序。”C类，荧光组件图像(面板1和2)表示产生的融合黄色的免疫荧光(面板4)在原子核外(面板5).D类，PKCδ和UGT1A10His的共同定位以COS-1表示。用免疫荧光法分析Co-localization用驴抗兔FITC结合物检测PKCδ，UGT1A10His为按照“实验程序。”荧光图像的组装(面板1和2)合并以生成黄色的荧光(面板4)如图所示(面板5). 背景免疫荧光未转染细胞的图像如补充图S4所示。比例酒吧代表20μm(A类)或10μm(B–D类).
图5。
图5。
A类，抗UGT-CE的特异性。非转基因和UGT1A7His-和-处理1A10His转染的COS-1细胞进行免疫沉淀“实验程序”中描述的反His。西方样品在4–15%SDS-PAGE系统中溶解后制备的印迹在“实验程序”中进行了描述反UGT-CE。B类PKCε和UGT1A7His的联合免疫沉淀在COS-1细胞中表达。终止实验后，其中UGT1A7His转染的COS-1细胞未经治疗或用75μ米姜黄素（如上所示）或钙蛋白C 1小时，60000×克产生的上清液如下所述“实验程序”与抗-His免疫复合，在SDS-10%PAGE系统中用蛋白A-Sepharose捕获以进行拆分，以及转印到硝化纤维素膜上。蛋白质迁移如下：β-COP，110 kDa；PKCε，96 kDa；和UGT1A7His，58 kDa。膜根据不同的“实验程序”进行了探索主要抗体如下：β-COP（ε-RACK），磷酸丝氨酸-PKCε、PKCε、磷酸丝氨酸、UGT-CE和His。C类UGT1A10His、PKCα和PKCδ的联合免疫沉淀。PKCα和PKCδ表达的免疫共沉淀UGT1A10-转染COS-1细胞，每个细胞用如图所示，用60000×克传说中描述的上清液B类.上清液与抗-His免疫复合，被蛋白质捕获在4至15%的SDS-PAGE系统中分离A-琼脂糖，并进行转印在硝化纤维膜上。
图6。
图6。
A类，花萼蛋白A对姜黄素抑制UGT活性的影响LS180细胞。Calyculin-A（6 n米)添加或不添加姜黄素或姜黄素（50μ米); 其对控制或抑制细胞的评估如图所示。（Calyculin-A是一种蛋白磷酸酶1抑制剂。）UGT活动的标准误差范围在±1至三次试验中±4%。B类，效果PKC激动剂对姜黄素（50μ米)-检测抑制的UGT30μ米DAG，2.0μ米PMA或100μg/mlPS，如图所示。控制活性为1817±88 pmol/mg蛋白质/h。UGT活动的标准误差范围在±2%和±5%之间三个单独的实验。C类，PKCε特异性的影响易位抑制剂对UGT活性的影响。非结合8-氨基酸肽（10月）（175μ米)或其加扰（Scr）控制被引入转化为皂苷（18） 描述的LS180电池在“实验程序”下。此外，PKC的基本原理同工酶特异性抑制在“实验程序和/或结果。控制活动为1952年±102 pmol/mg蛋白质/h面板A–D使用过的辣椒素和丁香酚（未显示）。*，第页≤ 0.01; **,第页≤0.001。D类，沉默PKCε对UGT1A7的影响活动。PKCε（100 n）特异性siRNA米)或控制siRNA（100牛顿米)在COS-1细胞中表达UGT1A7持续24小时；培养持续48小时，然后采集细胞丁香酚或我的邻苯二甲酸的葡萄糖醛酸化，如图所示（参见参考文献。51）培养2小时。对于Western blot分析，样品通过如上所述的离心（7） 和60000×克上清液在4~15%SDS-PAGE系统中溶解transblotted。对于西方分析，抗PKCε、抗UGT-CE和如前所述使用抗β-肌动蛋白(7). *,第页≤ 0.01;**,第页≤ 0.001.E、 在体外转录、翻译、，以及PKCε对UGT1A7His的磷酸化。pcDNA3.1-UGT1A7His构造被线性化并转录以合成新生蛋白在体外PKCε依赖性磷酸化[γ-33P] ATP，如“试验程序”；相应地，对小份的kinased样品进行计数。亲和纯化对照和实验样品[33P] UGTHis公司在重复凝胶中进行分析。其中一个干燥后用于放射自显影，另一个是用于带有抗UGT-CE的Western blot，如“实验程序。”样本在底部属于E类.**,第页≤ 0.001.
图7。
图7。
活性氧对LS180细胞UGT活性的影响。 A类，控制用0.4和4.0μg/ml过氧化氢酶处理LS180细胞40 min或1.0、2.0和5.0μ米herbimmycin-A 40分钟*，第页≤0.01; **,第页≤ 0.001.B类，用0.5或1.0米米H（H）2O（运行）25分钟和10分钟B类用4.0μg/ml过氧化氢酶预培养(猫酶)或5.0 μ米herbimycin-A(草本植物)在增加1.0 m米H（H）2O（运行）2再加5英镑或10分钟。细胞也用50μ米姜黄素30最小值或250 n米在添加1.0之前，将磷酸钙-C保持30分钟米米H（H）2O（运行）2持续10分钟，测量UGT活性丁香酚的控制值为8431±141 pmol/mg蛋白质/h。A以辣椒素为底物观察到类似的轮廓，第页≤0.01; **,第页≤ 0.001.
图8。
图8。
激动剂和拮抗剂对PKC活性影响的拟议模型其控制UGT活动。PKC示意图说明了两种模式调控：1）成熟的上游磷脂酰肌醇依赖激酶-1酪氨酸激酶磷酸化保守的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸(20,21,36,39），分别在催化结构域生成假定的活性PKC，以及2）变构长期调节剂（PMA）或脂质衍生短期激动剂（DAG）和PS（图6B类),通过监管域激活合格的PKC（36）触发连接特定的细胞结构。尽管示意图显示直接基于平行姜黄素/钙蛋白-C的PKC磷酸化ER-bound UGT磷酸丝氨酸的抑制/放射性标记[33P] 正磷酸盐和UGT活动（图3，A–C)UGT1A7获得了新的基底PKCε易位导致丝氨酸432磷酸化缺失的活性抑制肽强烈提示PKCε直接磷酸化UGT1A7（7）。姜黄素或钙磷蛋白C抑制PKC与分子结构的连接(7,33,36)（图5，B类和C类). 此外，细胞氧化剂和活性氧可以激活PKC通过在监管领域（10，47）和/或通过刺激PKC的酪氨酸磷酸化（图。7B类). 通过与PKC激活一致H（H）2O（运行）2-受刺激的酪氨酸磷酸化被herbimycin-A（20，21），我们观察到由两种试剂组成和过氧化物刺激的UGT（图7，A类和B类). 由于细胞暴露于高浓度氧化抗氧化剂，如姜黄素和去甲二氢愈创木酸（4） ，可能会中断关键催化域中的半胱氨酸(10,43,47）的抑制作用50 μ米姜黄素，但不是25μ米（未显示），在两者上PKC磷酸化和UGT活性与姜黄素抗氧化剂一致行动。低水平（1.0–10μ米)抗氧化多酚可以起到化学预防作用，清除氧化剂(52). UGT可能具有高的K（K）米值（≥10μ米)（4） 和PKC同工酶差异抑制灵敏度（图。2） 多酚使PKC-UGT信号通路适应不同的条件和保持功能对有益的化学预防行动。
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