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.2008年8月;19(8):3415-25.
doi:10.1091/mbc.e07-11-1164。 Epub 2008年5月28日。

DHHC2影响四spanins CD9和CD151的棕榈酰化、稳定性和功能

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DHHC2影响四spanins CD9和CD151的棕榈酰化、稳定性和功能

钱丹·夏尔马等。 分子生物学细胞. 2008年8月.

摘要

虽然棕榈酰化显著影响四spanin蛋白的生物化学和功能,但相关的棕榈酰化酶尚不清楚。有23种哺乳动物“DHHC”(Asp-His-His-Cys)蛋白,可能是棕榈酰化不同的蛋白质底物。在所测试的DHHC蛋白中,DHHC2最能刺激四spanins CD9和CD151的棕榈糖基化,而非活性DHHC2(DHHC基序中含有DH-->AA或C->S突变)不能促进棕榈糖基化合。此外,DHHC2与CD9和CD151相关,但与其他细胞表面蛋白无关,并且DHHC2敲除降低了CD9和CD151的棕榈糖基化。敲除其他六种Golgi-resident DHHC蛋白(DHHC3、-4、-8、-17、-18和-21)对CD9或CD151没有影响。DHHC2选择性地影响四spanin棕榈酰化,但不影响整合素β4亚基和[(3)H]棕榈酸酯标记的全细胞裂解物中可见的体蛋白的棕榈酰化。DHHC2依赖性棕榈酰化也具有多种功能效应。首先,它促进了CD9和CD151之间以及α3整合素和其他蛋白质之间的物理联系。其次,它保护CD151和CD9免受溶酶体降解。第三,DHHC2的存在,而非其他DHHC蛋白的存在,使细胞从分散状态转向细胞间接触增加。

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图1。
图1。
用于CD9和CD151棕榈酰化的DHHC蛋白的筛选。用指示的DHHC蛋白瞬时转染HEK293细胞。36小时后,细胞在含有5μg/ml蓝绿色素的培养基中饥饿1小时,然后用[H] 棕榈酸在含有1%Brij 96的缓冲液中溶解前2小时。分别用MM2/57和5C11单克隆抗体免疫沉淀CD9(A)和CD151(B),以显示H标记蛋白(顶部)和总免疫沉淀CD9和CD151蛋白(中部)。图中还显示了H标记蛋白归一化为总免疫沉淀蛋白(底部)。(C) 用CD151-Myc和DHHC-GFP蛋白共同转染HEK293细胞。36小时后,细胞饥饿1小时,代谢标记为[H] 棕榈酸2 H。细胞在含有1%NP-40的缓冲液中溶解。用Myc单克隆抗体从裂解液中免疫沉淀CD151。然后用Myc单克隆抗体检测膜上CD151的表达。相对于蛋白质表达标准化的棕榈酰化信号显示为密度单位(右;*p<0.05)。(D) 通过抗GFP和-FLAG抗体的印迹分析每个转染的裂解液中DHHC蛋白的表达。
图2。
图2。
野生型和突变型DHHC2对CD9和CD151棕榈酰化的影响。(A) 用DHHC2或其突变体与CD151-myc或CD9-myc共同转染HEK293细胞。36小时后,细胞代谢标记为[H] 使用抗myc抗体免疫沉淀棕榈酸、CD151和CD9,然后根据[H] 棕榈酸酯释放或c-Myc印迹。蛋白质表达标准化的密度单位显示为条形图(*p<0.05)。(B) 稳定表达DHHC2的A431细胞及其突变体被代谢标记为[H] 棕榈酸酯。然后,将内源性CD9和CD151进行免疫沉淀,并基于[H] 棕榈酸酯释放,并使用抗CD9和-CD151抗体进行免疫印迹。右侧,密度单位定量(*p<0.05)。在A和B中,GFP标记的野生型和突变型DHHC2蛋白的表达通过GFP印迹进行验证(右)。
图3。
图3。
DHHC2介导的棕榈酰化特异性。(A) 将稳定表达野生型和突变型DHHC2的A431细胞代谢标记为[H] 棕榈酸酯在1%Brij 96中溶解,然后免疫沉淀β4整合素。[H] 检测到棕榈酸酯标记(顶部)、β4蛋白(底部)和CD151蛋白(数据未显示)。密度单位(标记/蛋白质)如条形图所示(*p<0.05)。(B) 用野生型和突变型DHHC2及其他DHHC蛋白瞬时转染HEK293细胞。之后[H] 棕榈酸酯标记,标记蛋白在全细胞裂解液中可见。
图4。
图4。
DHHC2和四spanin联合。(A) 稳定表达DHHC2(GFP标签)和载体(GFP)的A431细胞在1%Brij 96中裂解;内源性CD9、CD147、CD151、整合素α3和C-Raf1免疫沉淀;然后通过GFP印迹检测相关DHHC2。(B) 在含有1%Brij 96的缓冲液中裂解稳定表达DHHC2及其突变体、DHHC15及其突变体和DHHC11的A431细胞。对内源性CD9和CD151进行免疫沉淀,并分别对CD151和CD9进行印迹。CD151免疫沉淀物也被α3整合素印迹。在底部的三个面板中,来自每个A431转染子的裂解物被探测CD9、CD151和GFP,以评估总蛋白水平。(C) 用野生型和突变型DHHC2瞬时转染HEK293细胞,标记有[H] 然后使用单克隆抗体A3X8免疫沉淀α3整合素。对同一膜进行α3表达的印迹。检测H标记蛋白(顶部)、α3整合素(中部)和GFP标记DHHC蛋白(底部)。
图5。
图5。
DHHC2的siRNA敲除。(A) 用siRNAs转染HEK293和MDA-231细胞,72小时后,对Brij 96细胞裂解物进行β-catenin、c-Src和CD9蛋白的印迹。(B) 用siRNAs转染HEK293细胞,72小时后,用1%Brij 96溶解细胞,并对整合素α3、肌动蛋白、CD9和CD151蛋白进行印迹。(C) 用流式细胞术分析用对照和DHHC2 siRNA处理的HEK293细胞,每实验计数约10000个细胞。使用MFI值,测定DHHC2击倒后每个细胞表面蛋白的残留百分比。除n=2(α3和β1整合素和CD44)或n=1(MHC I和CD147)外,所有病例均为n=3。两种不同的抗CD151和三种不同的抗CD9单克隆抗体产生了相似的结果。对照组MFI值范围为17至25(α3和CD44),所有其他细胞表面蛋白的MFI值为50至200。(D) 用对照或DHHC2#10 siRNA转染MDA-231细胞,标记有[H] 棕榈酸酯(2h)和标记蛋白在总细胞裂解液中可见。
图6。
图6。
敲除多个DHHC蛋白。(A) 用不同的DHHC和对照siRNA转染HEK 293细胞,代谢标记为[H] 棕榈酸酯(2 H),然后在1%Brij 96中溶解细胞,并免疫沉淀内源性CD9。蛋白质通过[H] 棕榈酸放射性(顶部)和印迹法(底部)。(B) HEK293细胞裂解液中还印有α3整合素、β-连环蛋白和CD151蛋白。(C) CD9的量是根据[H] 棕榈酸酯标记和免疫印迹。根据CD151蛋白免疫印迹定量CD151的数量,相对于对照β-连环蛋白进行标准化(*p<0.01)。
图7。
图7。
棕榈糖基化缺失伴随着表达缺失。(A) 用对照或DHHC2#10 siRNA瞬时转染HEK293细胞。24小时后,用未突变的CD9-myc或棕榈酰化缺陷的CD9-myc(缺乏膜近端半胱氨酸)瞬时转染细胞。再过48小时,在1%Brij 96中溶解细胞,然后对其进行Myc、CD151和α3整合素的印迹。密度单位来自Myc印迹的密度扫描(例如,在通道2和4中),相对于对照标准化(例如,分别在通道1和3中)(*p<0.05)。(B) 用对照组和DHHC2#10 siRNA转染HEK293细胞。转染后36和48小时,将酸性蛋白酶抑制剂Bafilmycin A1(100 nM)添加到DHHC2 siRNA处理的样品中。72小时后裂解细胞,通过免疫印迹法测定CD9、CD151和α3的稳态表达。展示了两个具有代表性的实验。四个实验的综合结果表明,敲除DHHC2显著增强了巴非霉素36小时的刺激作用。用对照siRNA刺激Bafilmycin,1.27±0.3;使用DHHC2 siRNA时为2.40±0.74(p<0.03)。(C) 用对照或DHHC2#10 siRNA转染MDA-231和A431细胞。转染36 h后加入Bafilomycin A1(100 nM),72 h后在1%Brij 96中裂解细胞,并免疫沉淀CD151。蛋白质通过检测[H] 棕榈酸酯(顶部)和CD151的吸墨剂(中部),这使得能够计算标准化密度单位(底部)。给出了两个具有代表性的实验。三个实验的综合结果表明,当巴非霉素也存在时,DHHC2 siRNA导致棕榈酰化显著降低。棕榈酰化,95±17%(DHHC2 siRNA,无巴非霉素);45±10%(DHHC2 siRNA加巴非霉素)(p<0.02)。
图8。
图8。
DHHC2击倒增强CD9降解。用对照或DHHC2 siRNA转染HEK293细胞。48小时后,用0.2 mCi/ml脉冲细胞[35S] 蛋氨酸1.5h,然后裂解(chase=0h)或用含有过量冷蛋氨酸的培养基进行不同时间的追逐。然后在1%Triton X-100中溶解细胞,免疫沉淀内源性CD9(A)和α3整合素(B)。然后分别用单克隆抗体MM2/57和单克隆抗体D23对膜进行印迹,以检测总CD9和α3整合素。图表显示了归一化为0小时时间点的相对蛋白质水平。
图9。
图9。
DHHC2的敲除影响A431细胞的分散。用对照DHHC2#10或其他DHHC siRNA转染A431细胞。72小时后,用抗CD151mAb 1A5和Alexa 594缀合的第二抗体对细胞进行染色。使用尼康Eclipse TE300倒置荧光显微镜,使用Spot软件(诊断仪器,密歇根州斯特林高地)采集图像。棒材,20μm。

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引用人

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    1. Berditchevski F.、Odintsova E.、Sawada S.、Gilbert E.棕榈酰化缺陷CD151的表达减弱了α3beta 1整合素与富含四spanin的微域的关联,并影响整合素依赖性信号传导。生物学杂志。化学。2002;277:36991–37000。-公共医学
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