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.2008年5月19日;181(4):605-13。
doi:10.1083/jcb.200712133。 Epub 2008年5月12日。

Plakophilin 2:调节细胞间连接组装的PKCα的关键支架

附属公司

Plakophilin 2:调节细胞间连接组装的PKCα的关键支架

阿曼达·E·巴斯-祖贝克等。 J细胞生物学. .

摘要

亲斑蛋白(PKP)是与经典钙粘蛋白相关蛋白p120(ctn)相关的犰狳家族成员。PKP定位于细胞间连接的细胞质斑块,参与连接中间丝结合蛋白结蛋白(DP)和桥粒钙粘蛋白。作为对细胞-细胞接触的反应,PKP2在细胞质中形成的斑块前体中与DP结合,并转移到新生的桥粒。在这里,我们提供证据表明,PKP2通过支架化DP-PKP2-protein kinase C alpha(PKC-alpha)复合体控制DP组装动力学,该复合体被PKP2敲除破坏。与IF紧密相关的磷酸化缺陷DP突变体的行为被PKP2和PKCα敲除以及PKC药理抑制所模仿,所有这些都会损害连接组装。PKP2敲低伴随着PKC底物磷酸化的增加,增加了PKC信号传导的整体改变可能有助于PKP2缺乏引起的先天性缺陷的发病机制的可能性。

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数字

图1。
图1。
PKP2是DP正确组装成桥粒所必需的。(A和B)PKP2缺陷培养物中DP边界定位受损。SCC9细胞(A,宽视野显微镜)或A431细胞(B,共焦显微镜)表达针对人类PKP2或非靶向(NT)对照的混合siRNA,免疫染色检测内源性DP和PKP2。对NT或PKP2 siRNA转染细胞中的SCC9(A,右)或A431(B,右)进行免疫印迹分析,以检测PKP2、PKP1、PKP3、DP、DSC2、DSG2、DSG3和α-微管蛋白的总水平。PG蛋白水平未受影响(未描述)。箭头指示单元格-单元格边界。(C) 在PKP2击倒期间,DP颗粒与角蛋白IF共定位。对表达PKP2或NT siRNA的SCC9细胞进行DP(绿色)和角蛋白(红色)免疫染色的共聚焦图像。面板b′和d′分别显示了a′和c′中方框区域的放大视图。(D) PKP2击倒期间DP组件受损。转染siRNA的SCC9细胞对PKP2、NT+siGlo、内源性PKP2或DP染色的钙开关。测量DP边界荧光强度,将其归一化为背景,并绘制在D(右)中。箭头表示siGLO粒子。误差条代表SEM。(E)DP在PKP2敲除期间以丝状细胞质模式累积。显示的是视频1和2中的静态图像(可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712133/DC1)描绘了PKP2或NT siRNA-转染的A431 DP-GFP细胞。箭头指示新边界的形成位置。红色箭头表示IF上的DP累积。时间点表示从视频开始经过的时间。棒材,10μm。
图2。
图2。
DPser2849和PKC活动需要进行适当的DP边界定位。(A,左)PKC抑制损害DP边界定位并诱导丝状模式。用12.5μM BIM或DMSO处理SCC9细胞30分钟,并对内源性DP进行免疫染色。(A,右)BIM处理的A431 DP-GFP电池。(B) PKA抑制不影响DP边界定位。低钙SCC9细胞经10μM H-89或DMSO处理后,转为高钙细胞3小时,免疫染色检测内源性DP。边界荧光强度的定量分析证实,在H-89处理的细胞中DP定位是可比较的。(C) Ser2849突变导致IF对齐(Godsel等人,2005年)。表达DP-GFP(a′)或DP的固定A431细胞2849G美元-GFP(b′)用于与D.(D,a′)视频4中的选定剧照(可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200712133/DC1)经12.5μM BIM处理的A431 DP-GFP细胞。该药物在视频开始时添加,并在整个90分钟的时间过程中保持。(D,b′)未经处理的A431 DP的视频52849G美元-GFP。箭头指示出现新的细胞-细胞接触的区域。注意DP中的可变性2849G美元-GFP模式从颗粒到连续细丝(与C相比)。(E) PKCα击倒期间DP边界定位受损。对感染PKCα小发夹RNA逆转录病毒或空病毒的SCC9细胞的钙开关进行DP免疫染色。测量DP边界荧光,将其归一化为背景,并在右侧绘制。针对DP、PKP2、DSG2、PKCα或GAPDH负载控制对PKC缺陷细胞进行免疫印迹分析。误差条代表SEM。误差条,10μm。
图3。
图3。
PKP2调节PKC信号。(A) PKP2敲除期间PKC底物磷酸化增强。从非靶向(NT)或PKP2 siRNA-转染细胞或经DMSO、15 nM PMA或12.5μM BIM处理30分钟的细胞裂解液中检测PKC底物磷酸化-MARCKS或-加合蛋白、总MARCKS、加合蛋白,PKP2或α-微管蛋白(负荷控制)。印迹下方的密度测定值表示与NT siRNA样品相关的处理样品中磷酸蛋白归一化与总蛋白的比率。(B) PKCα共免疫沉淀PKP2 N端头部,但不沉淀中央犰狳重复结构域。将FLAG标记的PKCα和myc标记的PKP2-头部或手臂共同转染到HEK293细胞中,并进行抗FLAG IP。用抗myc或抗FLAG抗体检测斑点。(底部)PKP2构造的示意图。5%的输入印迹代表进行IP的triton裂解物的5%,在IP进行免疫印迹分析之前去除。(C) PKCα协同免疫沉淀HEK293细胞内源性DP。将FLAG标记的野生型PKCα或肉豆蔻酰化(组成活性)PKCα转染到HEK293细胞并进行FLAG IP。对沉淀物和裂解物进行内源性DP或FLAG检测。数据是三个独立实验的代表。(D) PKC–DP交互需要PKP2。从转染PKP2或NT siRNA的HEK293细胞中免疫沉淀PKCα-FLAG,检测内源性DP、PKP2和FLAG。数据是三个独立实验的代表。密度测定(右)显示与PKCα免疫沉淀的DP减少95%。
图4。
图4。
PKP2、PMA或PKCα恢复DP并入桥粒。(A) PKP2再表达增强了PKP2击倒过程中DP边界的定位。在SCC9细胞中,沉默抗性FLAG标记的PKP2与PKP2或非靶向(NT)siRNA共表达。对细胞进行DP(右)、FLAG和PKP2染色(使用相同的二级抗体;左)。最右边显示了转染细胞对或未转染细胞组边界处的DP边界荧光强度。*,P<0.001。(B) PKC激活可在PKP2击倒期间拯救DP边界定位。用15nM PMA处理PKP2 siRNA或NT siRNA细胞30分钟,并对其进行DP染色。DP边界荧光定量显示在底部。**,P<0.001。(C) PKC表达可在PKP2敲除期间挽救DP边界定位。转染PKP2或NT siRNA的SCC9细胞被野生型PKCα或组成型活性PKCα逆转录病毒感染,并进行PKP2和DP染色。(C,top)PKCα的过度表达拯救了DP边界定位。(C,底部)通过考虑占据边界的百分比、边界连续性和荧光强度,评估细胞-细胞边界处的DP定位的稳健性。边界按1-5分制进行评分,并绘制为计算的总边界的百分比。(C,右下角)代表边界从1分到5分。5代表最成熟的边界,具有最连续和强烈的DP荧光,1代表最不成熟边界,具有最小或无DP荧光。图表示三个独立实验的平均值。NT和PKP2 siRNA实验同时进行,但为了清晰起见,在图中分开。误差条代表SEM。误差条,10μm。
图5。
图5。
PKP2在PKC-调节DP组装中的作用模型。(A) 野生型。PKP2将PKC招募到DP细胞质复合体,其中Ser2849的DP磷酸化调节其与IF的相互作用,并允许DP组装到细胞-细胞连接处。(B) PKP2缺乏。PKC不再被征募到DP复合物中,并且可以自由磷酸化其他底物,导致DP沿着IF异常积聚,并损害DP组装。

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引用人

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