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.2008年4月25日；283(17):11565-74.
doi:10.1074/jbc。M800436200。 Epub 2008年2月27日。

一种新的内源性人CaMKII抑制蛋白通过稳定p27诱导细胞周期阻滞抑制肿瘤生长

王春梅 1, 南丽, 刘星光, 郑媛媛, 曹雪涛
附属公司

一种新的内源性人CaMKII抑制蛋白通过稳定p27诱导细胞周期阻滞抑制肿瘤生长

王春梅等。 生物化学杂志. .

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摘要

钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）调节多种生理功能。在许多情况下，主要通过合成试剂抑制CaMKII活性已被证明可以抑制细胞生长。到目前为止，还没有关于内源性CaMKII抑制蛋白在细胞周期进程中的生理功能和潜在机制的报道。在这里，我们报道了一种新的人类内源性CaMKII抑制剂，人类CaMKI抑制蛋白α（hCaMKIINalpha）的特性，该抑制剂直接与激活的CaMKIl相互作用并有效抑制CaMKII活性。hCaMKIINalpha的表达与人类结肠腺癌的严重程度呈负相关。hCaMKIINalpha的过度表达通过其保守抑制区（27CIR）阻止S期细胞周期，从而在体内外抑制结肠腺癌的生长，而沉默hCaMJIINAlpha的表达可加速肿瘤生长和细胞周期进展。我们发现hCaMKIINalpha对细胞周期的影响与p27表达的上调相关，这可能是由于抑制蛋白酶体降解而非转录调节p27。此外，hCaMKIINalpha使MEK/ERK失活，这是抑制Thr-187磷酸化和随后p27蛋白酶体降解的先决条件，导致细胞周期S期进展受到抑制。这些发现强调了hCaMKIINalpha介导的CaMKII活性抑制与p27依赖性通路在控制肿瘤细胞生长和细胞周期方面的联系，并暗示hCaMJIINalpha-在结肠癌治疗中的潜在应用。

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数字

图1。
图1。
新型CaMKII抑制剂hCaMKIINα的鉴定蛋白质。 A类，hCaMKIINα与其同系物。使用GCG包进行校准。相同的残留物被遮住黑色。上行表示27CIR。这个GenBank™登录号为AY204901、AF271156、AY037149和分别为AF041854。B类，内源性表达之间的相互作用hCaMKIINα到CaMKII。用离子霉素处理HT-29细胞5分钟后溶解和免疫沉淀(IP（IP）)使用抗hCaMKIINα或抗CaMKIIα抗体。CaMKII和hCaMKIINα在使用所示抗体检测免疫沉淀物。C类,hCaMKIINα截短突变体的图示。27CIR突出显示，并指示截断的剩余。D类,His标记的hCaMKIINα或突变表达载体，或模拟（空载体）与pFLAG-CaMKIIα共转染LoVo细胞。细胞使用（或不使用）离子霉素来激活CaMKII。细胞裂解使用镍次氮基三乙酸珠沉淀使用指示抗体(上部面板). 用于商品及服务税下拉测定在里面体外hCaMKIINα与CaMKII的结合，等量GST融合蛋白质与转染LoVo细胞的裂解物孵育pFLAG-CaMKII（含或不含CaCl）2，用沉淀谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠，并用指示的抗体(下部面板).E类，抑制CaMKII活性hCaMKIINα。等量的重组hCaMKIINα蛋白添加到激酶反应中，CaMKII激酶活性由在体外激酶测定(上部面板). 用于抑制hCaMKIINα的自主CaMKII活性，LoVo细胞被转染用hCaMKIINα或突变载体转染HT-29细胞hCaMKIINα特异性siRNA（si-KIINα）。转染后48小时，用抗CaMKIIα抗体对细胞进行裂解和免疫沉淀。这个自主CaMKII活性由在体外激酶测定(下部面板). 数据显示一份中三份的平均值±S.D三个实验的代表性实验。*,第页<0.01与模拟或控制；**,第页< 0.01与si-Non或控件。
图2。
图2。
hCaMKIIN的表达模式α.A类，PCR分析hCaMKIINαmRNA在成人正常组织和肿瘤中的表达细胞系。所有样本的β-肌动蛋白均呈类似阳性(降低面板).B类hCaMKIINα蛋白的Western blot分析使用抗hCaMKIINα抗体在肿瘤细胞系中表达。全部样本中肌动蛋白也同样呈阳性(下部面板).C类,hCaMKIINα蛋白在正常和肿瘤结肠组织中的表达通过组织芯片分析。阵列用免疫染色通过标准免疫组织化学方法检测抗hCaMKIINα抗体。那里单独使用二级抗体作为阴性对照时无染色。这些照片代表了一个正常粘膜、癌旁组织和肿瘤的例子组织(上部面板)、正常、I级、II级组和1个III级组无hCaMKIINα表达的示例(降低面板)分别是。D类，hCaMKIINα蛋白概述在正常和肿瘤结肠组织中表达。对于统计分析，根据推荐标准分析所见染色强度由制造商提供。无肿瘤时强度为阴性细胞（细胞核和细胞质）染色，当肿瘤占10-20%时变弱当肿瘤细胞染色>20%时，细胞染色强。
图3。
图3。
hCaMKIINα抑制肿瘤细胞生长在体外和在里面活泼地.A类，LoVo细胞转染hCaMKIINα表达载体或模拟载体和HT-29细胞被转染si-KIINα或加扰控制（si-Non）。体外细胞生长如图所示，通过MTT检测。B类、SW480、SW620、HT-29和用hCaMKIINα表达载体转染LS-174T细胞在体外48小时后用MTT法检测细胞生长转染。C类，LoVo细胞的细胞增殖hCaMKIINα表达载体和转染HT-29细胞溴脱氧尿苷的FACS分析检测了si-KIINα转染后48h并入。D类，的体内生长LoVo和HT-29细胞在肿瘤内表达或敲除hCaMKIINα。hCaMKIINα表达载体的裸DNApKIINα或siRNA-生成载体pI-KIINα体内分别电穿孔至已建立的LoVo或HT-29肿瘤，空白矢量作为模拟，PBS作为对照。*,第页< 0.05与模拟或控制。
图4。
图4。
hCaMKIINα通过上调第27页。 A类，LoVo细胞转染hCaMKIINα表达载体和转染si-KIINα的HT-29细胞。48小时后转染后，细胞用碘化丙啶染色进行细胞周期分析由FACS提供。数据显示了三个实验中的一个实验代表。B类用si-KIINα转染HT29细胞。24小时后转染后，细胞被pKIINα转染1–5348 h，并通过FACS进行细胞周期分析。数据显示一三个实验的代表性实验。C类，LoVo细胞转染hCaMKIINα表达载体。转染后48小时，抗细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E免疫沉淀(IP（IP）)cdk2激酶活动分析如下在体外激酶分析。第21页和第27页Western blot分析检测其表达。D类，HT-29细胞转染si-KIINα，Western检测p27表达转染48h后进行blot分析。E类，LoVo细胞转染带有p27特异性siRNA(si-p27型)或si-Non。转染后24小时，用pKIINα转染细胞并用MTT检测细胞生长在指定的时间进行测定。
图5。
图5。
hCaMKIINα通过抑制蛋白酶体增强p27表达退化。 A类p27启动子活性和mRNA表达。结肠癌细胞将p27PF或对照pGVB2质粒与pKIINα。收集转染后48小时的细胞并进行裂解在里面体外荧光素酶活性报告试验。平均值±S.E指出了三个独立的实验(左侧面板). p27 mRNA使用特异性引物通过实时定量PCR分析表达pKIINα转染LoVo细胞48小时内p27和β-肌动蛋白组转染后(右侧面板). p27与β-肌动蛋白和S.E。B类，si-KIINα转染用MG132（10μ米)或DMSO 2小时前收获。转染后48小时，细胞裂解物接受Western用指示的抗体进行杂交。C类，HT-29细胞为用FLAG-p27和si-KIINα联合转染，并用MG132或DMSO收获前2小时。对转染后48小时的细胞进行裂解和到Western印迹(工作分解结构)带有指示的抗体。D类、LoVo用pKIINα或模拟载体转染的细胞与环己酰亚胺（10μ米)在收获前的指定时间。48h转染后的细胞被裂解并用显示抗体。
图6。
图6。
hCaMKIINα通过MEK/ERK调节p27磷酸化发送信号。 A类，蛋白质印迹分析LoVo细胞中MEK1/2、ERK1/2和p27过度表达hCaMKIINα和突变体转染48小时后。B类，LoVo细胞缺乏血清24 h，然后转染hCaMKIINα表达载体。细胞是在转染后的指定时间收获，并接受Western用指示的抗体进行杂交。C类，活动检测转染LoVo细胞的免疫沉淀Raf-1或MEK1转染后48h通过髓鞘碱性蛋白磷酸化。数据显示三份代表一份实验的三份样品的平均值±S.D实验。*,第页< 0.01.D类，HT-29细胞为转染si-KIINα。转染细胞处理48小时后含U0126（10μ米)24小时，裂解，并接受Western如图所示进行涂抹。
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    1. Berridge，M.J.、Lipp，P.和Bootman，M.D.（2000）《分子细胞》国家版。生物1 11-21-公共医学
    1. Carafoli，E.（2002）Proc。国家。阿卡德。科学。美国99 1115-1122-项目管理咨询公司-公共医学
    1. De Koninck，P.和Schulman，H.（1998）《科学》279 227-230-公共医学
    1. Piol，M.R.、Berchtold，M.W.、Bachs，O.和Heizmann，C.W.（1988）FEBS Lett。231 445-450-公共医学
    1. Lorca，T.、Galas，S.、Fesquet，D.、Devault，A.、Cavadore，J.C.和Doree，M.（1991）EMBO J.10 2087-2093-项目管理咨询公司-公共医学

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