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.2008年4月1日；111(7):3498-506.
doi:10.1182/bloud-2007-08-105346。 Epub 2008年1月14日。

转录因子Erg通过VE-cadherin调节血管生成和内皮细胞凋亡

格雷姆·M·伯德西 1, 尼古拉·德莱顿, 瓦莱丽·阿姆塞勒姆, 弗兰克·盖巴特, 卡皮尔·萨赫南, 多里安·哈斯卡德, 伊丽莎白·德贾纳, 贾斯汀·梅森, 安娜·M·兰迪
附属公司

转录因子Erg通过VE-cadherin调节血管生成和内皮细胞凋亡

格雷姆·M·伯德西等。 血液. .

摘要

细胞凋亡和存活之间的平衡的严格调节对血管生成至关重要。体外内皮管形成需要ETS转录因子Erg。使用反义寡核苷酸抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中Erg的表达，导致细胞间接触的分离和细胞死亡的增加。通过反义抑制HUVEC中Erg的表达也会降低粘附分子血管内皮（VE）-钙粘蛋白的表达，钙粘蛋白是内皮细胞间连接和存活的关键调节因子。通过染色质免疫沉淀，我们发现Erg与VE-cadherin启动子结合。此外，在反式激活测定中发现Erg可增强VE钙粘蛋白启动子的活性。VE-cadherin-GFP的过度表达部分挽救了Erg抑制诱导的细胞凋亡，表明VE-cadherin参与了Erg依赖性生存信号。为了显示Erg在体内血管生成中的作用，我们在Matrigel栓塞模型中使用抗Erg的siRNA。Erg抑制导致血管形成显著减少，caspase阳性内皮细胞（EC）增加。这些结果确定了通过转录因子Erg和粘附分子VE-cadherin调节血管生成和内皮细胞存活的新途径。

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图1
图1
内皮细胞中Erg表达的抑制。HUVEC（105)生长在明胶涂层的6孔板上的细胞转染对照GB或Erg特异性GB（100 nM）48小时。（A） 使用RT-PCR定量RNA提取物中的Erg mRNA水平，并将其归一化为GAPDH。GB治疗后Erg mRNA表达显著降低***P（P）< .001. 数值为平均值加上或减去SEM，n=4。（B） 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）免疫印迹法，结合Erg和tubulin抗体对全细胞蛋白提取物进行分析。Erg-GB处理的细胞中Erg蛋白表达显著降低**P（P）< .01. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。（C） 免疫荧光分析GeneBloc治疗前后Erg的分布和表达。如上所述，将生长在明胶涂层玻璃盖玻片上的细胞转染GB。48小时后，标记细胞并观察Erg（顶部）或核标记TOPRO-3（底部）。比例尺，100μm。（D） 用RT-PCR从GB-处理的HUVEC的RNA提取物中检测到的ICAM-2 mRNA水平，根据GAPDH标准化，在Erg抑制后显著降低**P（P）< .01. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。（E） 经Erg-GB处理的HUVEC中ICAM-2蛋白表达也下调，这是通过SDS-PAGE免疫印迹法测定的，该方法使用针对微管蛋白标准化的ICAM-2抗体*P（P）< .05. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。
图2
图2
Erg调节连接完整性和VE-cadherin表达。（A） HUVEC（105细胞/孔）生长在明胶涂层的6孔板上，用对照GB或Erg特异性GB（100 nM）转染48小时。相差显微镜显示，对照细胞（左）中显示的典型鹅卵石单层在Erg抑制的细胞（右）中已被破坏。原始放大倍率20×/0.4 Plan N物镜（日本东京奥林巴斯）。（B） HUVEC（105)生长在明胶涂层的6孔板上的细胞转染对照GB或Erg特异性GB（100 nM）48小时。使用针对GAPDH标准化的RT-PCR，从GB-处理的HUVEC的RNA提取物中测定VE-粘附素mRNA水平。Erg抑制后VE-cadherin mRNA显著降低*P（P）< 0.05. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。（C） 在Erg-GB处理的HUVEC中，VE-cadherin蛋白表达也下调，这是通过SDS-PAGE免疫印迹法测定的，该免疫印迹方法使用VE-cadherin抗体，并针对微管蛋白进行标准化*P（P）< .05. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。（D） 如上所述，用GB处理在明胶涂布的玻璃盖玻片上生长的HUVEC。48小时后，使用多克隆兔抗Erg抗体对细胞进行Erg标记，使用小鼠单克隆抗VE-cadherin抗体对细胞标记VE-cadherin。用AlexaFluor 488（绿色）显示Erg，用AlexaFluor 555（红色）显示VE-cadherin，用TOPRO-3（蓝色）染色细胞核。比例尺，100μm。使用的物镜是Plan Neofluar 20×/0.5（德国耶拿卡尔蔡司）。（E） 人类VE-cadherin基因近端5′-区的基因组DNA序列。转录起始位点被指定为+1。Ets结合位点（EBS）的位置被装箱。小鼠序列中存在的2个功能性EBS在人类中保守，由一个双线框表示。与ChIP分析中使用的寡核苷酸相对应的核苷酸序列（见面板F）用箭头表示。序列5′端和3′端的阴影核苷酸表示用于启动子PCR扩增的寡核苷酸的位置，以便随后克隆到pGL4荧光素酶报告质粒。（F） 按照“方法”所述，从融合的HUVEC单层进行染色质免疫沉淀。免疫沉淀后，使用兔抗Erg多克隆抗体或阴性对照兔IgG获得基因组DNA，作为PCR反应的模板，引物跨越VE-cadherin启动子的一个区域，该区域包含4个ETS结合位点。与阴性对照IgG（Neg）相比，140 bp（碱基对）的扩增产物在Erg沉淀染色质样品（Erg）中富集。为了确保Erg与VE-cadherin启动子结合的特异性，还使用VE-cadherin基因座3′区特异性引物作为阴性对照，对相同样本进行PCR扩增。使用阴性对照引物进行PCR，从两个样品中得到等量的产物，表明未捕获DNA。（G） 将Erg cDNA表达质粒（pSG5Erg）与VE-cadherin启动子-荧光素酶构建物共转染HeLa细胞，测定荧光素酶活性。数值表示为仅在空pGL4载体上相对荧光素酶活性的折叠变化。VE-cadherin启动子也与空表达质粒（pSG5）共转染。Erg反式激活VE-cadherin启动子**P（P）< .01. 数值为平均值加上或减去SEM，n=5。
图3
图3
Erg抑制增加HUVEC的凋亡。（A） HUVEC（105)生长在明胶涂层的6孔板上的细胞转染对照GB或Erg特异性GB（100 nM）48小时。细胞在乙醇中固定并用碘化丙啶染色。副G1流式细胞术检测凋亡细胞核。抑制Erg可使细胞凋亡增加3倍*P（P）< .05. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。（B） 通过测定caspase-3或-7活性证实了Erg对细胞凋亡的调节作用。HUVEC（2×10三)生长在96个微孔板中的细菌按上述方法处理。48小时后，使用胱天蛋白酶-3或-7 Glo测定法（Promega）测量发光*P（P）< .05. 数值为平均值加上或减去SEM，n=4。
图4
图4
VE钙粘蛋白保护HUVEC免受细胞凋亡。（A） HUVEC（105)用腺病毒（VE-卡德林[VEC]–-GFP和GFP）转导生长在6孔板中的细胞。四天后，用流式细胞仪测定GFP表达水平，并用共焦显微镜观察GFP自身荧光。使用的物镜为Plan-Neofluar 40×/1.3油（卡尔蔡司）。VE-cadherin–GFP定位于内皮细胞连接处。（B） 为了量化细胞凋亡，将细胞固定在乙醇中并进行碘化丙啶染色。副G1流式细胞术检测凋亡细胞核。VE-cadherin–GFP的表达显著降低细胞死亡*P（P）< .05. 数值为平均值加上或减去SEM，n=7。（C） HUVEC（105)用腺病毒（VEC-GFP和GFP）转导生长在6孔培养皿中的细胞。48小时后，用对照GB或Erg特异性GB（100 nM）转染细胞。再过48小时，将细胞固定在乙醇中，并用碘化丙啶染色以确定细胞凋亡。在VE-cadherin过度表达的细胞中，Erg抑制诱导的细胞凋亡显著降低，表明Erg调控的生存途径涉及VE-cadherin*P（P）< .05, **P（P）< .01. 数值为平均值加上或减去SEM，n=7。
图5
图5
Erg siRNA抑制体内血管生成。（A） HUVEC（105)将生长在明胶涂层的6孔板上的对照siRNA或Erg特异性siRNA（30 nM）转染48小时。使用RT-PCR定量Erg mRNA水平，并将其归一化为GAPDH。Erg-siRNA处理后Erg mRNA表达显著降低**P（P）< .01. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。（B） 用抗Erg和微管蛋白抗体的SDS-PAGE免疫印迹法分析全细胞蛋白提取物。Erg-siRNA处理的细胞中Erg蛋白表达显著降低**P（P）< .01. 数值为平均值加上或减去SEM，n=3。根据使用ICAM-2抗体的SDS-PAGE免疫印迹测定，Erg-siRNA处理的HUVEC中ICAM-2蛋白表达也下调。（C） 向C57BL/6小鼠皮下注射含有siRNA（2μM）和或不含bFGF（80 ng/mL）的Matrigel混合物。植入7天后取出基质塞，固定，切片，H&E染色。（i） 不含bFGF的基质胶塞。（ii）Matrigel堵头加bFGF。（iii）带有bFGF和Erg siRNA的Matrigel塞。（iv）带有bGFF和荧光素酶控制siRNA的Matrigel塞子。含有红细胞的新生血管（箭头）。原始放大倍数为10×/0.25平面物镜（奥林巴斯）。通过计算包含管腔和红细胞的结构数量来量化血管密度。**表示P（P）小于.01。数值为加上或减去SEM的平均值，n=5。（D） 用荧光素酶（i，iii）或Erg（ii，iv）siRNA处理的Matrigel塞子切片用CD34（i，ii）或CD45（iii，iv）抗体染色，并用免疫荧光共聚焦显微镜观察，覆盖透射光DIC图像，以观察塞子的血管结构。对于CD34（红色），新生血管内皮细胞的染色最为强烈（箭头所示）。泛白细胞CD45抗体（紫色）将Matrigel基质内炎性浸润的孤立细胞和新生血管管腔内的白细胞染色（箭头）；然而。CD45型+如前所述，在新生血管中也发现了细胞。用Sytox Green对细胞核进行复染。插图：IgG阴性对照。使用的物镜为Plan Neofluar 20×/0.5（卡尔蔡司）。比例尺代表50μm。（E） Matrigel塞切片中抗Erg抗体的免疫组织化学染色。（i） 新生血管内皮细胞在Luc-siRNA处理的栓塞中表达Erg（箭头所示）。（ii）用Erg siRNA处理的塞子显示Erg染色减少。插入：控制IgG。原始放大倍数20×/0.4 Plan N物镜（奥林巴斯）。比例尺代表50μm。（F） （i）在经Luc-siRNA处理的Matrigel塞样品中发现罕见的凋亡细胞，如抗活性caspase 3染色所示（箭头）。（ii）在Erg siRNA-处理的Matrigel塞样品中发现活性Caspase 3阳性EC，并与血管壁分离（箭头所示）*P（P）< .05. 数值为平均值加上或减去SEM n=3 Erg和n=5对照。比例尺代表50μm。
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