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.2008年2月；22(2):263-72.
doi:10.1210/me.2007-0324。 Epub 2007年10月11日。

CBP是雌激素受体抑制核因子-κB的剂量依赖性调节因子

肯德尔·W·奈特尔斯 1, 德国Gil, 杰森·诺瓦克, 拉斐尔·梅蒂维尔, Vandana B Sharma公司, 杰弗里·格林
附属公司

CBP是雌激素受体抑制核因子-κB的剂量依赖性调节因子

Kendall W Nettles公司等。 分子内分泌学. 2008年2月.

摘要

雌激素受体（ER）通过抑制促炎转录因子核因子-κB（NFkappaB）来保护机体免受炎症反应的衰弱作用。迄今为止，cAMP反应元件结合蛋白（CREB）结合蛋白（CBP）被建议通过作为连接ER和NFkappaB的支架或作为竞争性结合一个或另一个转录因子的必需辅因子来调节抑制性串扰。然而，这里我们证明ER被招募到MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）和IL-8启动子的NFkappaB反应元件中，并取代MCF-7乳腺癌细胞系中的CBP，而不是p65。相反，ER从IL-6启动子中取代了p65和相关协调剂，表明CBP在整合炎症和类固醇信号方面具有基因特异性作用。此外，RNA干扰和过度表达研究表明，CBP剂量调节雌激素介导的MCP-1和IL-8抑制，但不调节IL-6基因表达。这项工作进一步证明，CBP剂量是ER和NFkappaB信号通路之间基因特异性信号整合的关键调节器。

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数字

图1
图1
ERα抑制NFκB依赖的MCP-1转录A，用TNFα和/或E2处理MCF-7细胞2 h，然后进行qPCR分析。mRNA水平归一化为18S mRNA。B、MCP-1的Northern印迹和GAPDH mRNA表达。MCF-7细胞在甾体缺失培养基中培养3d，并用50 ng/ml TNFα刺激2 h（如图所示）。培养物在10 n时补充类固醇受体配体米除非另有规定：E，雌二醇；OHT，4-羟基三苯氧胺；100牛顿米4-羟基三苯氧胺；己烯雌酚；E1，雌酮；ORG 2058，一种合成孕激素；DHT，二氢睾酮。这些斑点是四个独立实验的代表。C、 从MCF-7细胞中分离细胞核，并进行连续转录分析以测量转录水平。D、 放线菌素用于抑制MCF-7细胞的转录。MCP-1 mRNA被归一化为GADPH mRNA。E，IκBα的Northern印迹和用指定配体处理的MCF-7细胞的GAPDH mRNA。孕酮受体；车辆，车辆。
图2
图2
将MCP-1基因MCF-7细胞中放射性标记NFκB反应元件寡核苷酸的凝胶位移处理30或60分钟，然后制成核提取物，证明E2对p65与DNA的结合没有影响。抗体。
图3
图3
ERα和p65 MCF-7细胞的免疫荧光分析在盖玻片上生长，用配体处理30分钟，甲醇固定，并进行免疫荧光显微镜染色。如之前报道的MCF-7细胞（31），TNFα治疗可诱导p65的弥漫性细胞核和细胞质染色。抗体。
图4
图4
ERα和p65 A之间的细胞联系，MCF-7细胞提取物的免疫沉淀，在细胞溶解前用配体处理30分钟。使用多克隆ERα抗体（ER21）进行沉淀，然后对p65（Santa Cruz anti-p65 A20）进行Western blotting。B类(左侧面板)用MCP-1荧光素酶报告子和ERα表达质粒转染Cos-1细胞。第二天，用TNFα+E2处理细胞6h，并进行荧光素酶活性处理；B类(右侧面板)如图所示，将p65和ERα表达质粒转染Cos-1细胞。48小时后，用TNFα+E2处理细胞30分钟，并裂解以提取蛋白质。只有LBD删除构造无法与p65交互(星号)尽管在全细胞提取物中高水平表达(箭头). C、 与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠结合的GST-ERαLBD融合蛋白用载体或1 m米E2持续1小时，然后用于下拉在体外-翻译的Grip1或p65。在大量洗涤后，用谷胱甘肽洗脱结合蛋白，并用SDS-PAGE和放射自显影术进行可视化。AF2，激活功能2；免疫沉淀；DBD，DNA-结合域；五、 车辆；T、 肿瘤坏死因子α；E、 雌二醇。
图5
图5
CBP在ERα-NFκB交叉对话A中的作用，MCP-1前荧光素酶报告子显示E2对MCP-1基因的抑制作用。用报告人转染细胞，并用Vehicle、TNFα或TNFα+E2处理细胞。所示为MCP-1启动子活性相对于载体的折叠诱导。我们确定了一种不显示E2抑制作用的MCF-7细胞克隆变体，称为MCF-7-ES细胞。B、 在MCF-7-ES细胞中测量MCP-1启动子活性，在不添加辅激活剂的情况下，其没有显示出E2的抑制。荧光素酶活性相对于载体对照显示。该荧光素酶报告子与越来越多的辅激活物表达载体或pBluescript共同转染，以使转染的总DNA正常化。第二天，用指定的配体处理细胞6小时。每个数据点一式三份，显示平均值+扫描电镜，实验重复四到五次。AIB1在乳腺癌中扩增1。
图6
图6
CBP置换介导雌激素依赖性基因抑制A，将汇合MCF-7细胞切换到含有炭样剥离血清的培养基中培养3 d。然后，如甲醛固定前所示，用TNFα和E2处理细胞3 h，并进行ChIP分析。使用同源抗体和相对定量PCR评估所述蛋白与pS2控制启动子和MCP-1增强子的结合。B、 Re-ChIP分析评估与MCP-1增强子区域结合的复合物中同时存在的指示蛋白质。非特异性抗体。
图7
图7
RNA干扰靶向CBP A，RT-qPCR基因表达分析。用所示配体处理MCF-7细胞2 h，并对所示基因表达进行分析，将其归一化为18S mRNA表达。B、RT-qPCR分析CBP或lamin基因表达。用所示的siRNA转染MCF-7细胞40小时，然后对层粘连蛋白A/C或CBP进行qPCR分析，结果显示其归一化为18S mRNA。C，以CBP为靶点的siRNA对炎症基因表达的影响。将所示siRNA转染MCF-7细胞40 h，然后用载体、TNFα或TNFα+E2处理2 h，然后进行基因表达的qPCR分析。NS，正常血清；TE、Tris-EDTA；车辆、车辆；五、 车辆；T、 肿瘤坏死因子α。
图8
图8
CBP是ER-NFκB串扰a的剂量敏感调节因子，用靶向CBP的siRNA和不同数量的pRSV-CBP表达载体转染MCF-7细胞。第二天，用载体、TNFα（15 ng/ml）和/或E2（100 n）处理细胞2 h米)，然后进行基因表达的qPCR分析。将所有mRNA水平正常化为18S后，靶基因表达相对于CBP的mRNA水平。B、 CBP与MCP-1基因中NFκB增强子相互作用的模型。CBP与CBP的N末端结构域具有良好的相互作用。ER不直接与p65交互，因此可能通过组装复合体的其他组件与CBP绑定竞争（详细信息请参阅正文）。辅酶A；N.S.，正常血清；α-管，α-微管蛋白。
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