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.2007年5月；18(5):1595-608.
doi:10.1091/mbc.e06-10-0886。 Epub 2007年2月21日。

高尔基带的生物成因：内质网膜输入和GM130的作用

皮尔弗朗西斯科·马拉 1, 洛伦娜·萨尔瓦多, 亚历山大·米罗诺夫, 安东内拉·迪坎普利, 朱塞佩·迪·图利奥, 阿尔瓦·特鲁科, 加利娜·贝兹努森科, 亚历山大·米罗诺夫, 玛丽亚·安东尼塔·德·马泰斯
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高尔基带的生物成因：内质网膜输入和GM130的作用

皮尔弗朗西斯科·马拉等。 分子生物学细胞. 2007年5月.

摘要

哺乳动物细胞中的高尔基复合体形成一条连续的带状物，由相互连接的扁平池组成。我们在此表明，这种独特的结构反映并需要内质网（ER）以多形性ER-高尔基体载体（EGC）的形式持续输入膜。高尔基织带生物成因的一个重要步骤是EGC完全并入堆叠中。这需要高尔基基质蛋白GM130，该蛋白在顺高尔基亚组和EGC之间持续循环。在获得GM130后，EGC经历同型栓系和融合，成熟为更大、更均匀的膜单元，这些膜单元似乎已准备好并入高尔基体堆栈。在缺乏GM130的情况下，这一过程受到损害，EGC仍然是不同的实体。这会导致小管上皮细胞膜的积聚、池的缩短和高尔基带的断裂。然而，在这些条件下，分泌物质仍然可以输送到高尔基复合体，尽管这种情况发生的效率较低，而且显然是通过EGC和高尔基池之间的短暂和/或有限的连续性。

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数字

图1。
图1。
在没有来自内质网的膜输入的情况下高尔基带碎裂。（A）在37°C的稳态下，GalT（红色）和giantin（绿色）的分布模式在HFs中显示出连续的网状结构。（B） CHX处理3小时后，这些Golgi-resident蛋白显示GC片段为离散元素。（C） 将VSV感染的细胞在40°C下培养3 h，固定并染色GalT（红色）和VSVG（绿色），GalT的染色模式再次破碎，VSVG保留在ER中，VSVG输送至GC。（E） 如A–C所示的GC碎片定量，显示LSCM下使用Z轴-叠加过程（背景减法后）。（F–M）HFs感染VSV，在40°C下保存3 h，以在ER（F–M）中累积VSVG。然后将其固定（J–M）或放置在15°C下，以在中间隔室中累积VSVG 15分钟，最后将其移动到40°C，以使累积在中间隔室内的VSVG在高尔基体中移动8分钟（F–I）。然后对细胞进行电子断层扫描。显示了具有类似定向GC的单元。显示了同一断层图中第一个（红色）、第十五个（绿色）和第三十一个（蓝色）虚拟序列切片的高尔基体剖面（红色）的叠加。箭头指示功能区中的断点。定量分析表明，在40°C培养的细胞中，带状断点的数量增加了2.5倍。棒材，2μm（A）；0.7微米（C）。
图2。
图2。
GM130介导EGC并入高尔基池。（A） VSV感染的CHO、低密度脂蛋白G细胞和用GFP-GM130转染的低密度脂蛋白G细胞（如图所示）用CHX和NZ在32°C下处理3小时（稳定状态），然后在没有（w/o）CHX的情况下转移到15°C处理2小时，然后在32°C下用CHX处理15分钟。显示了高尔基体堆栈和EGC的典型EM图像。棒材，120 nm。（B） A中所示处理下EGC和GC的形态分析（见材料和方法).
图3。
图3。
高尔基体带在GM130耗尽的细胞中被碎裂。（A和B）HFs注射N309抗GM130抗体，在37°C下1小时后固定并染色N309（A；绿色）和giantin（A和B；红色）。在非注射细胞（右下）中，giantin染色呈网状且连续；在N309注射细胞中（左上角），它显示离散的小点状物（A和B，箭头）。（C和D）COS7细胞转染GFP-G95，20小时后（当未检测到内源性GM130时；补充图S1）固定；显示GFP-G95荧光（C；绿色）和giantin染色（D；红色）。请注意，与未转染细胞相比，转染细胞（D，星号；右）中的栀子苷染色模式紊乱。（E和F）CHO（E）和低密度脂蛋白G细胞（F）的giantin（红色）染色。请注意，在低密度脂蛋白G细胞中，CHO细胞中没有相互连接的环状结构的规则模式，这显示出小的固体分散点状结构。对（G和H）Hela细胞进行模拟处理（G）或用siRNAs处理GM130（72 H；H），并固定和染色giantin（红色）。棒材，3μm（A、B、E和F）；10μm（C和D）；2μm（G和H）。
图4。
图4。
在没有GM130的情况下，ER-高尔基体循环蛋白在EGC中积累。将转染GFP-GM130（C）的CHO（A）、ldlG细胞（B）和ldlG淋巴细胞固定并进行KDELR染色。注意，KDELR主要存在于ldlG细胞的外周点状结构中，而在CHO细胞和转染GFP-GM130（C，星号）的ldlG细胞中也存在于中央GC上。插图，（C）中转染细胞的GFP-GM130染色（绿色）。（D） 将N309抗体（星号）注入COS7细胞，并对其进行KDELR染色。注意，与非注入细胞（左上角）相比，KDELR重新分布到N309注入细胞的外围。插图，D中转染细胞的N309染色（绿色）。（E） 用G95转染COS7细胞并进行KDELR染色。请注意，与未转染细胞相比，G95过度表达细胞（星号）中KDELR的外围重分布（底部）。插入，E中转染细胞的GFP-G95染色（绿色）。棒材，8μm（A、B和E）；5μm（C和D）；7.5μm（插入C和E）；16μm（插入D）。（F） 定量KDELR的外周再分布。外周点状结构和心周高尔基体结构的荧光之间的比率以相对对照细胞（未处理或模拟注射的COS7细胞用于表达G95的细胞；N309注射的COS7细胞和CHO细胞用于低密度脂蛋白G细胞；以及用GFP-GM130转染的低密度脂蛋白G细胞）的百分比表示。
图5。
图5。
GM130缺失会导致高尔基体条带断裂、池缩短和小管泡膜积聚。对对照组和N309注射的HFs（A和B）以及对照组和G95-过度表达的COS7细胞（C）进行EM（A和C）和形态分析（B），如材料和方法CHO和ldlG细胞（D–G）通过EM连续切片（D和E）或EM断层扫描（F和G）进行分析。D和E的底部面板显示了连续六个连续剖面中高尔基体（蓝色）和小管和囊泡（绿色）剖面的重叠。F和G中的底部面板显示了3D EM断层扫描重建顺式-大多数（红色）和反式-大多数（洋红）池。囊泡（蓝色，50-60nm；白色，80-90nm）由软件生成的球体表示，以囊泡中心为中心。棒材，1μm（A和C–E）；600 nm（F和G）。（H） 从CHO细胞、ldlG细胞和表达GFP-GM130的ldlG电池的连续切片中对高尔基区进行形态计量学分析（参见材料和方法). 叠层合并是指一段上两个明显不同的叠层变成下一段上的一个叠层。这些聚合事件的数量与节中的堆栈数量有关。
图6。
图6。
GM130阳性EGC比GM130阴性EGC大，结构更复杂。（A–H）COS7细胞在稳定状态下进行GM130（A和D；绿色）和COPI（B和E；红色）染色，并进行CLEM（C和F–H；参见材料和方法). 在免疫电镜标记和纳米金增强（F–H为50-nm厚的连续切向序列切片）后，对单独含有GM130（A–C，箭头）或同时含有GM130和COPI（D–H，箭头）的EGC进行GM130检测。将（I–P）COS7细胞感染VSV并置于40°C下3 h。然后将细胞移至32°C下15 min，并对（I）进行VSVG（红色）和GM130（绿色）染色，并处理CLEM（J–P；参见材料和方法). 在I中，G表示高尔基地区；N和划定的区域表示原子核。在连续的连续切片（J、K和M–O）中，通过纳米金增强进一步标记VSVG。编号箭头（I–P）显示相应的GM130阴性（箭头1和2）和GM130阳性（箭头3）EGC。显示GM130阴性（L）和GM130阳性（P）EGC（蓝色）和ER（棕色）的连续连续切片的叠加。棒材，10μm（A、B、D和E）；3μm（I）；200 nm（C和F–H）；500 nm（J、K和M–O）；和700 nm（L和P）。（Q） 免疫荧光和EM水平下EGC直径之间的相关性（参见材料和方法). 请注意，90%以上的GM130阳性EGC的大小至少在一个维度上大于12像素（对应450±150 nm），而绝大多数（80%）的GM130阴性EGC较小（数据未显示）。
图7。
图7。
COS7细胞中GM130阳性EGC的动力学。（A） 在延时显微镜下对表达GFP-GM130的细胞（对照）的外周运动结构进行成像。选定帧在指定时间显示；箭头表示合并的结构（00.03–00.29），然后一起移动（01.02–01.08），直到它们不再可解析（02.00）。（B） 定量可归因于GM130阳性（GM+）和GM130阴性（GM−）EGC的聚结事件以及显示聚结事件的每类EGC。用VSV-YFP和CFP-GM130共同转染细胞，在40℃下保存12 h，然后转移到32℃，5 min后在延时显微镜下成像。（C–F）注射突变αSNAP L294A的GFP-GM130表达细胞（对照）、GFP-G95过度表达细胞（G95）和GFP-GM130-表达细胞被固定（C和D）或在延时显微镜下成像（E和F）。（D） 定量GM130阳性EGC的大小和数量，如c所示（如图所示）。（E） 在延时显微镜下，表达GFP-GM130并注射αSNAP L294A的细胞中EGCs的非生产性聚结事件。两个EGC（箭头）明显会聚并（00.006–00.27），然后迅速分开（00.45，00.48）并分别移动到不同的目的地（00.52，00.55）。（F） 总聚结事件和非生产性聚结事件的定量，如C和E所示（如图所示）。棒材，3μm（A和E），10μm（C）。
图8。
图8。
GM130的缺失导致货物到达高尔基复合体的动力学延迟，但其糖基化没有缺陷。（A） VSV感染的COS7细胞注射对照抗体或N309抗体，在40°C下孵育2小时，转移到32°C下指定时间，然后对N309（绿色）和VSVG（红色）进行染色。15分钟后，VSVG主要定位于模拟注射细胞的GC中，而在N309注射细胞中仍位于外围结构中（顶部面板，星号）。60分钟后，VSVG到达模拟注射细胞和N309注射细胞的质膜（底部面板，星号）。（B） CHO和ldlG细胞感染了VSV，并在32°C下与CHX共同孵育3小时。CHX洗脱后，将细胞移到15°C下孵育2小时，以使VSVG在中间隔间内积聚，然后在32°C下与CHX共同孵养15分钟。将细胞固定并染色以检测VSVG，CHO细胞可见VSVG位于GC中，而ldlG细胞则保留在外围结构中。棒材，10μm（A）；5微米（C）。（C） 输送至质膜的VSVG的定量计算为质膜处VSVG（在未渗透细胞中用抗腔VSVG抗体标记）与总VSVG之间的比率（GFP标记）。转染GFP-VSVG的N309注射细胞中的VSVG转运显示为模拟注射细胞中VSVG运输的百分比。（D） 如（C）所示，VSVG的ER到高尔基体转运的量化。这是根据相关对照细胞（N309注射的COS7细胞和G95表达的COS8细胞；ldlG细胞的CHO细胞）外周结构中的VSVG染色与缺乏GM130的细胞（通过N309注入或G95表达，或ldlG细胞；如图所示）中GC中的VSV G染色之间的比率计算得出的。（E–J）分析含有或不含有GM130以及含有或不含完整高尔基带的细胞中外源和内源分泌蛋白的翻译后处理。（E） 在GFP-LDLR转染的CHO和ldlG细胞中评估LDLR的翻译后修饰。脉冲后使用[35S] 蛋氨酸和20和40分钟的追逐，细胞被裂解，细胞裂解物用抗GFP抗体免疫沉淀；m、 成熟；p、 GFP-LDLR的前体形式。（F） 通过脉冲相实验和Endo-H处理，分析了新合成的VSVG在CHO和ldlG细胞以及表达GFP-GM130（ldlG+GM）的ldlG细胞中的糖基化。追逐20和40分钟后，细胞被溶解[35S] -标记的VSVG通过SDS-PAGE进行分析，在不使用和使用Endo-H治疗的情况下（如图所示）。追踪60分钟后，通过细胞表面生物素化测定VSVG转运到质膜的比例。VSVG在ldlG细胞和转染GFP-GM130的ldlG细胞中，与CHO细胞相比，在追踪的所有时间内，VSVG均表现为较低的分子量带，并以这种方式运输到细胞表面。此外，在ldlG细胞中，与CHO细胞相比，在20分钟时观察到Endo-H耐药性的获得延迟，40分钟后恢复。追踪60分钟后，对照组和GM130缺失细胞之间未发现实质性差异。（H） 通过在对照细胞（COS7、CHO和HFs）中用Endo-H处理或在用NZ裂解高尔基体带后（如图所示）分析新合成的VSVG的糖基化。对照细胞和处理细胞之间的VSVG糖基化模式没有差异。（一） 内源性HCAM糖蛋白的糖基化模式是通过用Endo-H或神经氨酸酶（Nase）处理细胞裂解物（来自模拟处理或GM130-siRNAs处理的HeLa细胞）来评估的。在对照细胞和GM130缺失细胞中，HCAM在稳定状态下被适当唾液酸化（如Nase处理后的带移位所示）。（J） 用Alexa fluor 488-凝集素GSII（末端特异性）对模拟处理或GM130-siRNA处理的HeLa细胞（72 h）进行染色N个-乙酰基-d日-氨基葡萄糖；绿色）或荧光素-凝集素SNAI（唾液酸专一；绿色；如图所示），以及栀子苷（红色）。对照和GM130耗竭的细胞之间没有显著差异，≥97%的细胞显示SNA凝集素的质膜阳性，≤3%的细胞显示GSII的质膜阳性（见材料和方法). 棒材，15μm。
图9。
图9。
ER和GM130的膜输入在高尔基带生物发生中的作用模型。在没有来自ER的膜输入的情况下（没有ER到高尔基体的传输），高尔基体带会断开连接成孤立的堆栈顺式-有窗池消失，池的总长度减少。在存在来自内质网的膜输入（内质网到高尔基体的运输）的情况下，内质网到高尔基体的载体（EGCs）被运输到GC：如果它们获得GM130（+GM130），它们经历同型聚结融合，产生更大、更均匀的盘状膜，这些膜被直接结合到堆叠中，在顺式并参与丝带的形成。在没有GM130（−GM130）的情况下，EGC并入堆垛会受到影响，它们仍然是不同的实体，但仍然能够通过与GC的有限连续性交付货物。这导致小管上皮细胞膜积聚，高度开窗的细胞消失顺式-大多数池，池的整体缩短和高尔基带的断开。
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