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.2006年12月；13(12):1069-77.
doi:10.1038/nsmb1172。 Epub 2006年11月12日。

SUMO蛋白酶SENP1诱导剪刀肽键异构化

沈林南（Linnan Shen） 1, 迈克尔·H·塔塔姆, 长江洞, 安娜·扎戈斯卡, 詹姆斯·奈史密斯, 罗纳德·T·海
附属公司

SUMO蛋白酶SENP1诱导断裂肽键的异构化

沈林南（Linnan Shen）等。 自然结构分子生物学. 2006年12月.

摘要

小的泛素样修饰物（SUMO）特异性蛋白酶SENP1将SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3加工成成熟形式，并将其与修饰蛋白质解偶联。为了建立蛋白水解机制，我们测定了与SUMO-1修饰的RanGAP1和未处理的SUMO-1结合的催化活性SENP1的结构。在每种情况下，可剪断肽键都与SUMO-1的C末端末端成直角扭结，并具有酰胺氮的顺式构型。SENP1优先处理SUMO-1而不是SUMO-2，但全长SUMO-1和SUMO-2与SENP1和K（m）值的结合热力学非常相似。然而，k（cat）值相差50倍。因此，SENP1对未加工SUMO-1和SUMO-2的区分基于催化步骤而非底物结合，可能反映了SENP1正确定位SUMO-1与SUMO-2中的科学键的能力差异。

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数字

图1
图1
SENP1 C603A和SUMO-1之间络合物的结构-改性RanGAP1。(一)综合体的总体结构。RanGAP1用红色缎带表示，SENP1 C603A用蓝色表示，SUMO-1用绿松石表示。RanGAP1的Lys524和SUMO-1的Gly97之间的等肽键显示为带有碳黄色、氮蓝色和氧红色的棒状物(b条)SENP1（C603A）–RanGAP1–SUMO-1复合体与Ubc9–RanBP2–RanGAP-SUMO-1复合物的叠加。Ubc9–RanBP2–RanGAP1–SUMO-1复合体中仅显示RanGAP1（洋红色）和SUMO-1（蓝色）；省略Ubc9和RanBP2。RanGAP1的Lys524与SUMO-1的Gly97之间的异肽键显示为碳绿色、氮蓝色和氧红色的粘连。叠加基于SUMO-1中的97 Cα原子。(c（c）)a中复合物的详细信息。文本中提到的残留物已注明。(d日)中叠加的细节b条。更常见的反式在Ubc9–RanBP2–RanGAP1–SUMO-1复合物中看到的异肽中酰胺氮的取向将导致与SENP1的Ser601发生严重的空间冲突。这迫使异肽采用顺式酰胺氮的排列。
图2
图2
绑定到SENP1 C603A的全长SUMO-1结构。(一)SENP1（C603A）–SUMO-1-FL复合物。青色，SENP1；紫色，SUMO-1-FL。SENP1与之前的描述完全相同。(b条)SENP1（C603A）–RanGAP1–SUMO-1复合物与SENP1–SUMO-1-FL复合物的叠加。在叠加的RanGAP1–SUMO-1复合物中，RanGAP1-呈红色，SENP1呈深蓝色，SUMO-1呈绿松石色。异肽键如图1a所示。(c（c）)建筑群详图一，SENP1为深蓝色，碳素SUMO-1-FL为粉红色。文中提及的残留物已注明。虚线表示氢键。(d日)相同的顺式在SENP1（C603A）-SUMO-1-FL处理复合体和SENP1（C603A）-RanGAP1-SUMO-1去偶联复合体中可以看到氮的排列（颜色如b条和c（c）).
图3
图3
SENP1 C603A诱导溶液中底物的构象变化。(一)针对全长SUMO-1或SUMO-2的SENP1处理（C末端水解酶）活性FRET底物图。从细菌中纯化出线性融合YFP–SUMO-FL-ECFP（列出N末端到C末端）。显示了剪刀键（箭头）C末端侧的序列。(b条)SENP1解偶联（异肽酶）活性的FRET底物图。细菌产生的YFP-RanGAP1与ECFP–SUMO-1-GG或ECFP-SUMO-2-GG结合在体外并纯化了共轭物。(c（c）)溶液中SENP1 C603A结合后RanGAP1–SUMO和SUMO-FL的构象变化。将YFP–RanGAP1–SUMO-1–ECFP、YFP-RanGAP1-SUMO-2–ECFP-、YFP-SUMO-1-FL–ECFP/或YFP-SUMO-2-FL–EC FP（各1000 nM）与指定浓度的非活性蛋白酶突变体SENP1 C603A混合。FRET信号（方法）根据“单独缓冲”控制标准化。SENP1 C603A与FRET SUMO结构的结合导致FRET信号强度的变化，这表示两个荧光团之间距离的变化。测量结果一式三份；误差条（±1 s.e.m.）被图表符号遮住。
图4
图4
SENP1 C603A基板和产品结合的热力学。ITC用于研究SENP1与SUMO-1-FL、SUMO-2-FL、RanGAP1-SUMO-1、SUMO-1-GG、SUMO2-GG或RanGAP1（如图所示）结合所影响的热力学变化。实验在三个不同的场合重复进行，结果非常相似。热力学参数如表1所示。
图5
图5
SENP1对SUMO-1和SUMO-2底物的异肽酶和C末端水解酶活性的稳态动力学分析。(一,b条)对于RanGAP1–SUMO-1、RanGAP–SUMO-2、SUMO-1-FL和SUMO-2-FL，SENP1的初始切割速率与底物浓度之间的关系。基于FRET的分析（方法）使用图3a、b中所示的底物。采用非线性回归法将不同底物浓度下的初始速率拟合到Michaelis-Menten方程。除含有10 nM SENP1的SUMO-2-FL外，我们在所有分析中使用了0.625 nM SENP1。(c（c）,d日)产物抑制对SENP1异肽酶和C末端水解酶活性的影响。基于FRET的SENP1蛋白酶分析具有固定的SUMO底物浓度（500 nM），指示范围为SUMO-1-GG和SUMO-2-GG浓度。图表包含误差条（±1 s.e.m.），在大多数情况下，误差条被图表符号遮盖。动力学参数如表2所示。
图6
图6
提出SENP1分解底物的机制。催化前可能发生两个可逆步骤。首先，底物（SUMO-目标）和SENP1之间存在关联，刺激色氨酸通道的打开。第二，色氨酸通道的关闭导致反式-顺式底物的scisile键的酰胺氮的异构化。然后可以进行化学催化，目标的水解和解离基本上是不可逆的。最后，产物SUMO-GG在发生新一轮催化之前从SENP1中的SUMO结合位点解离。
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中的注释

  • 用古怪的SUMO分手。
    Huang DT，Schulman文学学士。 Huang DT等。 自然结构分子生物学。2006年12月；13(12):1045-7. doi:10.1038/nsmb1206-1045。 自然结构分子生物学。2006 PMID：17146457 没有可用的摘要。

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参考文献

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