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.2006年10月10日；103（41）：15091-6。
doi:10.1073/pnas.0607260103。 Epub 2006年10月2日。

DJ-1是一种癌症和帕金森病相关蛋白，稳定抗氧化剂转录主调节器Nrf2

凯西·M·克莱门茨 1, 理查德·麦克纳利, 布莱恩·孔蒂, Tak W Mak公司, 詹妮·P·Y·汀
附属公司

DJ-1是一种癌症和帕金森病相关蛋白，稳定抗氧化剂转录主调节器Nrf2

凯西·M·克莱门茨等。 美国国家科学院程序. .

摘要

DJ-1/PARK7是一种与癌症和帕金森病（PD）相关的蛋白质，可保护细胞免受毒性应激。然而，这种保护的功能基础仍然难以捉摸。我们发现DJ-1的缺失导致NQO1[NAD（P）H醌氧化还原酶1]（一种解毒酶）的缺陷。这种缺陷归因于Nrf2（核因子-红细胞2相关因子）的缺失，Nrf2是抗氧化转录反应的主要调节因子。DJ-1通过阻止与其抑制剂蛋白Keap1的结合以及Nrf2随后的泛素化来稳定Nrf2。如果没有完整的DJ-1，Nrf2蛋白是不稳定的，因此转录反应在基础上和诱导后都会降低。DJ-1对Nrf2的这种影响存在于人类和小鼠的转化系和原代细胞中。DJ-1对Nrf2的影响以及随后对抗氧化反应的影响可能解释了DJ-1如何影响癌症和帕金森病的病因，这两种疾病似乎是不同的。此外，DJ-1/Nrf2功能轴在癌症治疗中提供了一个治疗靶点，并证明DJ-1是一个肿瘤生物标记物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
siRNA介导的DJ-1基因敲除和基因芯片分析。(A类)转染对照siRNA（siCTL）或两种不同siRNA靶向DJ-1（siDJ-1#1和siDJ-1#2）的H157细胞的端点RT-PCR。DJ-1 RT-PCR凝胶呈负像，因此可以更容易地显示条带。NTC是一个非模板控件。(B类)siRNA-转染H157细胞的Western blot分析显示DJ-1在蛋白质水平上被击倒。(C类)siRNA转染后DJ-1 mRNA的实时定量PCR。相对mRNA定量标准化为18S rRNA表达。与siDJ-1#1相比，siDJ-1#2降低DJ-1表达的程度更大，而用打乱的非特异性低聚物siRNA或单独的转染试剂（siMOCK）转染均不影响DJ-1的表达。
图2。
图2。
Affymetrix基因芯片分析总结。所示基因表示siCTL-和siDJ-1转染样品之间的变化大于3倍；在所有样品中，当前（P）状态下的荧光>500。绿色表示归一化荧光表达减少；红色表示较高的表达。假设转录起始位点上游1000 bp内的Nrf2-binding序列包含在右侧，并通过tfsearch进行鉴定，得分>85.0。
图3。
图3。
Nrf2介导的转录需要DJ-1。(A类)mRNA表达的实时定量PCR分析证实，siDJ-1#2降低了DJ-1 mRNA表达以及NQO1 mRNA的表达。然而，Nrf2的mRNA（NQO1表达的主要调节因子）不受DJ-1缺失的影响。所有实验均一式三份，误差条显示SEM(B类)转染siDJ-1后，Huh7细胞中ARE调节的荧光素酶报告基因活性降低。萤火虫荧光素酶报告子结构受NQO1 ARE（43）控制，该ARE对Nrf2有反应。用50μM tBHQ或DMSO载体对照物处理细胞。分析裂解液的荧光素酶活性，并将其归一化为提取物中的粗蛋白。Flag-Nrf2作为阳性对照转染。DJ-1表达降低的样品含有较低水平的ARE调节的荧光素酶活性，并且在用tBHQ治疗后未能增加荧光素酶活性。所有实验一式三份进行，误差条表示SEM(C类)由组成活性病毒SV40启动子控制的构建物表达的荧光素酶活性不受siDJ-1的影响。(D类)两个哺乳动物启动子表达的荧光素酶活性不受siDJ-1的影响。在NQO1 ARE、糖皮质激素反应元件（GRE）或cAMP反应元件（CRE）的控制下，用荧光素酶报告基因构建体转染具有siDJ-1的Huh7细胞。用适当的载体对照物、50μM tBHQ、100μM地塞米松（DEX）或10μM forskolin（FOR）处理培养物，如图所示。活化表现为对照低聚物（siCTL）转染细胞的诱导百分比。所有实验都至少重复了三次。
图4。
图4。
Nrf2蛋白稳定性需要DJ-1。(A类)在DJ-1被siRNA敲除后，对Huh7细胞裂解液中的Nrf-2、DJ-1和控制蛋白进行Western blot分析。(B类)环己酰胺（CHX）处理后蛋白质表达的时间进程。Western blot分析证实CHX处理后对照样品中有时存在Nrf2。Actin用作未受影响的控件。(C类)在赛璐珞中Nrf2泛素化测定。从Huh7提取物中免疫沉淀Nrf2和共价结合泛素，并用SDS/PAGE和Western blot分析。(D类)DJ-1存在下Nrf2/Keap1共免疫沉淀。V5表位标记的Keap1在带有和不带有过表达Flag-DJ-1的Huh7细胞中表达。使用抗V5抗体联合免疫沉淀内源性Nrf2蛋白的免疫沉淀，反之，免疫沉淀内源Nrf2联合分离的V5-Keap1。“H.C.”表示免疫沉淀抗体中存在的IgG重链交叉反应带。数据代表至少三个独立实验。
图5。
图5。
MEF中的Nrf2功能需要DJ-1。(A类)Western blot分析DJ-1基因缺失小鼠和WT同窝小鼠初级MEF中mNrf2蛋白的表达。用tBHQ在0、50和100μM下处理培养物。(B类)对转染pcDNA或Flag-DJ-1并用50μM tBHQ或载体对照处理的mNrf2培养物进行Western blot分析。(C类)DJ-1中的ARE-淀粉酶活性+/+和DJ-1−/−MEF文化。荧光素酶受来自人类NQO1基因启动子的ARE控制(左侧); SV40荧光素酶受组成活性病毒SV40启动子的控制(赖特). 荧光素酶活性标准化为提取物中的蛋白质浓度。(D类)原发性MEF中Nrf2介导靶基因表达的实时定量PCR。NQO1，NAD（P）H醌氧化还原酶I；谷胱甘肽半胱氨酸连接酶修饰亚基。与对照组相比，用tBHQ治疗后的数据显示为折叠诱导。所有mRNA测量值均按照小鼠G3PDH表达标准化。所有实验一式三份，误差条显示SEM。所有数据都代表了至少三个独立的实验。
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