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.2006年10月;26(20):7409-19.
doi:10.1128/MCB.00585-06。 Epub 2006年8月14日。

PGC-1相关辅活化子:与细胞色素c启动子占用和呼吸生长相关的CREB/NRF-1结合域的即时早期表达和特征

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PGC-1相关辅活化子:与细胞色素c启动子占用和呼吸生长相关的CREB/NRF-1结合域的即时早期表达和特征

克里斯特尔·维考特伦等。 分子细胞生物学. 2006年10月.

摘要

PGC-1相关辅激活子(PRC)最初被描述为与PGC-1α具有相同结构和功能特征的转录辅激活子。两种共激活因子都与核呼吸因子1(NRF-1)相互作用,并激活呼吸链表达所需的NRF-1靶基因。在这里,我们确定PRC属于在从静止到增殖生长的过渡过程中快速诱导的即刻早期基因。正如其他这类成员所观察到的那样,PRC mRNA的快速血清诱导不需要从头开始蛋白质合成,而蛋白质合成的抑制使PRC mRNA稳定,导致其超诱导。先前的工作表明,PRC通过结合NRF-1和CREB的顺式作用元件激活细胞色素c的表达。在这里,我们证明,与NRF-1一样,CREB在体外与PRC结合,并存在于细胞提取物中与PRC的复合物中。CREB和NRF-1在PRC上结合相同的位点,与CREB的相互作用需要CREB b-Zip DNA结合域。此外,细胞色素c启动子的反式激活需要PRC上的CREB/NRF-1相互作用域,含有该域的PRC亚片段在慢病毒载体的反式表达中抑制半乳糖的呼吸生长。最后,PRC在体内与细胞色素c启动子相关,在血清诱导静止成纤维细胞时,PRC对启动子的占有率显著升高。结果表明,PRC是一种即时早期基因产物,可以靶向关键转录因子,作为细胞增殖程序中的早期事件。

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数字

图1。
图1。
环己酰亚胺对PRC mRNA诱导和稳定的影响。(A) 在没有或存在10μg/ml环己酰亚胺的情况下,对缺乏血清的静止BALB/3T3成纤维细胞进行指定时间的血清刺激。星号表示P(P)与未处理细胞的相应值相比,值<0.05。(B) 在没有或存在10μg/ml放线菌酮的情况下,对静止的BALB/3T3细胞进行血清刺激1小时,然后用5μg/ml的放线菌素D处理。星号表示P(P)与仅用放线菌素D处理的细胞相比,值<0.05。(C) 用5μg/ml放线菌素D处理饥饿细胞、血清刺激细胞或融合细胞后,测定PRC mRNA的半衰期。对于所有三个面板,在指定的时间分离总RNA,并用18S rRNA作为内部标准,通过定量实时PCR测定PRC m RNA的相对量。结果表示为三次独立测定的平均值的平均值±标准误差。
图2。
图2。
PRC蛋白水平的鉴定和定量。(A) 通过使用提高到分子的三个不同亚区[抗PRC(95-533)、抗-PC(1047-1379)和抗-PR(400-467)]的抗体,在293FT细胞提取物中鉴定出PRC蛋白。从转染空载体(pSV-Sport)或表达完整PRC开放阅读框(PRC/pSV-Sort)的载体的细胞中制备提取物。(B) 从增殖细胞、血清饥饿细胞或用血清刺激饥饿细胞3或8小时制备BALB/3T3或U2OS细胞总提取物。在这两个面板中,通过变性凝胶电泳和免疫印迹,使用所示抗体(A)或抗PRC(1047-1379)(B)检测蛋白质。
图3。
图3。
PRC与NRF-1、CREB或HCF体外相互作用的比较。PRC的示意图显示在顶部,显示了各种功能域(点画,激活域;交叉阴影,富含脯氨酸区域;灰色,宿主细胞因子[HCF]的共识识别位点[DHDY];黑色,R/S域;垂直阴影,RNA识别基序)。指定为A、B、C或D的PRC亚片段,其氨基酸坐标显示在括号中,用于S标签下拉测定35S-标记转录因子NRF-1、CREB或HCF。将各种子碎片绑定到每个子碎片35将S-放射性标记转录因子与S-标记硫氧还蛋白作为阴性对照进行比较。结合蛋白从S蛋白琼脂糖中洗脱出来,并通过放射自显影术进行可视化。
图4。
图4。
PRC和CREB之间的体内相互作用。(A) 用pSG5/CREB-HA电穿孔后,HA-标记的CREB在293FT细胞中表达。分别用2.5或7.5μg兔IgG免疫沉淀细胞提取物作为阴性对照(1道和2道)、抗PRC(95-533)(3道和4道)或抗PRC的(1047-1379)(5道和6道)。用蛋白A-琼脂糖降低免疫复合物,洗涤并在SDS-10%PAGE凝胶上运行。为了进行比较,使用20μg细胞提取物(第7道)。转移后,用小鼠抗HA单克隆抗体进行免疫印迹检测。(B) 用2.5或7.5μg兔IgG免疫沉淀293FT细胞提取物作为阴性对照(1道和2道)或抗PRC(1047-1379道)(3道和4道)。如面板A所述,沉淀免疫复合物并进行电印迹。为了进行比较,使用2 ng重组NRF-1(第5道)。转移后,用山羊抗NRF-1抗体进行免疫印迹检测。每个面板的左侧显示了以千道尔顿为单位的分子质量标准。
图5:。
图5:。
删除PRC中NRF-1/CREB相互作用域的精细映射。PRC的示意图显示在顶部,各种功能域如图3图例所示。构建了PRC(400-698)和PRC(1379-1664)亚片段的一系列缺失,显示它们与NRF-1和CREB结合,并且它们与这两个亚片段的体外结合水平35使用S-tag下拉分析比较S-标记转录因子。将不同亚片段的结合与S-标记硫氧还蛋白作为阴性对照进行比较。结合蛋白从洗涤的珠子中洗脱出来,并通过放射自显影术进行可视化。图中显示了每个缺失的相对长度,其右侧有一个数字表示其氨基酸坐标。在体外下拉分析中结合(+)或不结合(−)每个转录因子的能力在每个子片段的右侧显示。底部显示了显示显著结合的最小亚片段的氨基酸序列。
图6。
图6。
缺失映射结合PRC所需的CREB区域。顶部显示了CREB的示意图,显示了各种功能域。全长CREB和C末端缺失,如图下方的实线所示,为35S标记并使用中华人民共和国上游CREB结合域(氨基酸400至604)(左侧面板)或下游CREB绑定域(氨基酸1379至1664)(右侧面板)进行S标记下拉分析。将CREB亚片段与每个PRC结构域的结合与S-标记硫氧还蛋白作为阴性对照进行比较。结合蛋白从洗涤的S蛋白琼脂糖中洗脱出来,并通过放射自显影术进行可视化。
图7。
图7。
中华人民共和国的决定因素反式细胞色素的活化c(c)发起人。细胞色素c(c)启动子荧光素酶报告子构建是反式在瞬时共转染测定中被全长PRC[PRC(1-1664)]或其突变衍生物[PRC(Δ433-467)和PRC(1-1379)]激活。在没有PRC亚片段或存在1或2μg表达PRC(400-604)或PRC(1-221)的质粒的情况下测量相对荧光素酶活性。通过使用雷尼利亚在双荧光素酶报告系统中控制荧光素酶,并表示六次单独测定的平均值±标准误差。单个星号表示P(P)与未诱导对照组相比,值<0.05。双星号表示P(P)与从全长PRC(1-1664)获得的值相比,数值<0.05反式激活。wt,野生型。
图8。
图8。
在含有葡萄糖或半乳糖作为主要碳源的培养基上,表达PRC(400-604)的细胞与表达TR的对照细胞的生长比较。(A) TR-或PRC/DN-表达细胞(DN,显性阴性)的全细胞提取物与野生型(wt)的免疫印迹比较。TR用兔抗TR抗体(Imgenex)检测,而PRC/DN用羧基末端V5标记的慢病毒表达,并用抗V5抗体(Invitrogen)检测。(B) TR-和PRC/DN-表达细胞在葡萄糖培养基上的生长。(C) 半乳糖培养基上TR-和PRC/DN-表达细胞的生长。面板B和C中的增长曲线表示三次单独测定的平均值±标准误差。

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