Glycosaminoglycan modification of neuropilin-1 modulates VEGFR2 signaling

doi:10.1038/sj.emboj.7601188

.2006年7月12日；25(13):3045-55.

doi:10.1038/sj.emboj.7601188。 Epub 2006年6月8日。

神经素-1的糖胺聚糖修饰调节VEGFR2信号

Yasunori Shintani先生¹, Seiji Takashima公司, 浅野义弘, 加藤久久, 廖玉林, 山崎佐人, 冢本修（Osamu Tsukamoto）, Osamu Seguchi先生, 山本裕久, 福岛富民, Kazuyuki Sugahara公司, 北泽Masafumi, Masatsugu Hori公司

附属公司

PMID： 16763549
预防性维修识别码：项目经理1500974
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601188

神经素-1的糖胺聚糖修饰调节VEGFR2信号

Yasunori Shintani先生等。欧洲工商管理硕士J. 2006.

.2006年7月12日；25(13):3045-55.

doi:10.1038/sj.emboj.7601188。 Epub 2006年6月8日。

作者

附属

¹大阪大学医学研究生院心血管医学系，日本大阪市住田。

PMID： 16763549
预防性维修识别码：项目经理1500974
内政部： 10.1038/sj.emboj.7601188

摘要

神经毛蛋白-1（NRP1）是血管内皮生长因子（VEGF）的共受体，与VEGFR2协同增强血管生成信号。VEGF信号通过其对血管内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（SMC）的影响，对生理和病理血管生成至关重要，但协调这种反应的机制尚不清楚。在这里，我们发现NRP1的相当一部分是在单个保守的Ser上用硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素修饰的蛋白聚糖。EC和SMC之间NRP1糖胺聚糖（GAG）链的组成不同。糖基化增加了这两种细胞类型中的VEGF结合，但NRP1的差异GAG成分介导了EC和SMC对VEGF的相反反应。最后，NRP1表达及其GAG修饰在转录后调节VEGFR2蛋白表达。这些发现表明，NRP1的GAG修饰在调节VEGF信号传导中起着关键作用，并可能为生理和病理血管生成提供新的见解。

PubMed免责声明

数字

图1
细胞NRP1的很大一部分是由HS或CS组成的蛋白聚糖。(A类)¹²⁵I标记的VEGF与EC和SMC中的不同蛋白质交联。箭头表示SMC中特异性的VEGF结合蛋白。CASMC：冠状动脉平滑肌细胞；BSMC：支气管平滑肌细胞；HUVEC：人脐静脉内皮细胞。(B类)CASMC或HUVEC中外源性表达NRP1的蛋白质印迹。分析前2天，在指定的MOI处转染编码FLAG标记NRP1的腺病毒。以LacZ编码腺病毒为对照。(C类)高分子量带并不是简单的共价连接的NRP1同二聚体。在CASMC中仅转染FLAG标记的NRP1或FLAG标记的和V5标记的NRP1两者，并且免疫沉淀细胞裂解物并通过所指示的抗体检测。(D类)内源性NRP1在SMC和EC中通过GAG链的添加而被修饰。经HSase和CSase处理后，CASMC免疫沉淀物上带消失。HUVEC表达的NRP1也被GAG修改。分析了条带强度，并确定了NRP1的每种聚糖形式的比例。数据来自三个单独的实验。HSase：肝素酶；C酶：软骨素酶。

图2
(A类)NRP1是在单个Ser上修改的GAG⁶¹²残留物。用编码WT或S612A突变NRP1的腺病毒载体转染CASMC。NRP1 S612A未修改GAG。(B类)不同物种NRP1的多重比对。序号⁶¹²在脊椎动物中高度保守。(C类)NRP2是NRP家族成员，未修改GAG。(D类)siRNA和腺病毒构建物的设计。序号⁶¹²存在于b1b2和MAM域之间的桥接区域。(E类)更换Ser⁶¹²作者：Ala⁶¹²NRP1的表达没有改变与VEGF的结合。用NRP1 WT′或S612A表达载体转染Cos7细胞，并在37°C培养基中预先孵育肝素酶（1.5 mU/ml）、肝素酶和软骨素酶（20 mU/ml）2 h，使NRP1非GAG形成¹²⁵I标记的VEGF在室温下放置30分钟，细胞裂解物由抗NRP1抗体免疫沉淀，结合放射性用γ计数器定量。数据来自三个独立的实验。对于面板E，误差条代表s.E。

图3
GAG修改对SMC和EC中NRP1功能的影响不同。(A类)SMC和EC中NRP1的实验替代。在用N-G siRNA和腺病毒构建物转染后，内源性NRP1被NRP1的糖基化形式（NRP1 WT′）或非糖基化类型（NRP1S612A）成功替换。Tubulin被用作负荷控制。(B类)在NRP1中添加GAG可增强这两种细胞与VEGF的结合。NRP1替换后两天，细胞裂解物与抗FLAG抗体孵育后免疫沉淀¹²⁵I标记的VEGF（25 ng/ml）在室温下放置40分钟，并使用γ计数器定量结合放射性。用这些免疫沉淀物进行肝素酶和软骨素酶治疗并不能完全消除VEGF结合的增强。数据来自三个独立的实验。(C类)VEGF（50 ng/ml）在表达非修饰NRP1 S612A的SMC中诱导的细胞迁移大于表达NRP1 WT′的SMC。通过在三个随机高功率场（HPF，×200）中计数细胞来量化迁移细胞。从另外两个独立实验中获得了类似的结果。(D类)与表达NRP1 S612A的内皮细胞相比，表达NRP1-WT′的内皮细胞中VEGF（50 ng/ml）增加了细胞活力。数据来自三个独立的实验。对于面板B–D，误差条代表s.e。^**P（P）*与B组中的腺-NRP1 WT′相比，<0.05。

图4
SMC中NRP1的GAG对VEGFR2的不同作用。(A类)实验性NRP1 S612A替代增加SMC中VEGFR2的表达，但替代并不影响EC中VEGFR2的表达。用siRNA和腺-NRP1转染细胞两天后，用Western blotting分析细胞。数据代表至少三个独立实验。(B类)Western blot定量结果。(C类)NRP1 S612A替代实验增加了SMC中VEGFR2蛋白的表达，而没有任何转录变化。每个样品都进行了两次分析，并对全套基因进行了三次实验。(D类)CS-modified NRP1与HS-ModifiedNRP1和非修饰NRP1对VEGF具有相同的亲和力。请注意¹²⁵I-标记的VEGF结合的CS-修饰NRP1在交联前具有相似的比率（通道4和8中的上带，CS-修饰的NRP1:HS-修饰的NFP1=2:1）。增加冷VEGF的量同样受到抑制¹²⁵I标记的VEGF与所有形式的NRP1结合。(E类)NRP1与VEGFR2的共免疫沉淀。与非改性NRP1（130 kDa，车道2、4、6、8）和HS改性NRP（车道6约250 kDa）相比，CS-改性NRP2（左侧面板，车道4约250 kDa）与VEGFR2的关联最小，尽管输入端（右侧面板）CS-改化NRP1比HS-改性NFP1高出两倍。膜被剥离，并用抗V5作为负载控制进行再防护。数据代表至少三个独立实验。(F类)与NRP1 S612A EC相比，NRP1 WT’EC中VEGFR2的降解速率降低。在VEGF之后的任何时间点，NRP1 WT′EC中的磷酸化VEGFR2也远高于NRP1 S612A EC。数据代表至少三个独立实验。对于面板B、C、F，误差条代表s.e。^**P（P）*与NG/NRP1 S612A相比，P<0.05。HSase：肝素酶；C酶：软骨素酶。

图5
NRP1转录后调节VEGFR2的表达。(A类)两种NRP1 siRNAs（N-G，N-1）均降低VEGFR2的表达。相反，VEGFR1不受NRP1敲除的影响。Tubulin被用作负荷控制。数据代表至少三个独立实验。(B类)NRP1敲除不影响VEGFR1和VEGFR2的转录水平。每个样品都进行了两次分析，并对全套基因进行了三次实验。(C类)HUVEC中的脉冲追踪实验。NRP1敲除不会改变VEGFR2的降解速率。数据来自四个独立的实验。(D类)NRP1显著上调Flp293/VEGFR2细胞中的VEGFR2蛋白水平。Flp293/VEGFR2细胞中转染NRP1的GAG修饰类似于EC。数据是两个独立实验的代表。(E类)NRP1调节细胞表面VEGFR2的表达。与相邻的非转染细胞相比，FLAG标记的NRP1 WT的瞬时表达上调了细胞膜相关VEGFR2的表达。用NRP1-WT或mock转染Flp293/VEGFR2细胞，并使用抗VEGFR2（绿色）和抗FLAG-Cy3（红色）进行染色，但不渗透。蓝色：DAPI核染色。对于面板A和C，数字表示三个实验的带强度的平均值。对于面板B，误差条代表s.e。

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