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.2006年6月2日;125(5):915-28.
doi:10.1016/j.cell.2006.03.044。

PPM1A作为Smad磷酸酶终止TGF-β信号传导

附属公司

PPM1A作为Smad磷酸酶终止TGF-β信号传导

夏琳等。 单元格. .

摘要

TGF-β信号控制多种正常发育过程和疾病的发病机制,包括癌症、自身免疫性疾病和纤维化疾病。TGF-β应答通常通过Smads的转录功能介导。TGF-β信号传导的关键步骤是配体诱导受体活化Smads(R-Smads)的磷酸化,该磷酸化由TGF-Ⅰ型受体激酶催化。然而,Smad去磷酸化作为TGF-β信号调节机制的潜力以及Smad特异性磷酸酶的鉴定尚不明确。使用功能基因组方法,我们已将PPM1A/PP2Alpha鉴定为真正的Smad磷酸酶。PPM1A脱磷并促进TGF-β活化Smad2/3的核输出。PPM1A的异位表达消除了TGF-β诱导的抗增殖和转录反应,而PPM1A缺失增强了哺乳动物细胞中TGF-α的信号传导。在斑马鱼Nodal-dependent早期胚胎发生过程中,也观察到PPM1A的Smad拮抗活性。这项工作表明,PPM1A/PP2Alpha通过Smad2/3的去磷酸化在终止TGF-β信号传导中起着关键作用。

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数字

图1
图1。Smad2/3的动态磷酸化和去磷酸化
(A) Smad2/3磷酸化的时间进程。在指定的时间段内,用2 ng/ml的TGFβ1处理HaCaT细胞。通过蛋白质印迹分析P-Smad2/3和总Smad2/3。左:表示三个独立实验的折线图。通过NIH Image软件对每个实验中P-Smad2/3相对于总Smad2/3的强度进行量化。值是至少两个独立实验的平均值;误差线是平均值的±标准偏差。右图:一个典型的西方污点。(B) 为(C)–(F)设计的治疗方案的示意图。(C) Smad2去磷酸化的分析。用2 ng/ml的TGFβ1处理HaCaT细胞30分钟,然后进行TGFβ洗脱,同时添加5μM SB431542和20μM MG-132。图表显示了三个独立实验的相对P-Smad2水平(超过总Smad2),数值和误差条表示平均值和标准偏差。插件是一个具有代表性的实验。(D) 实验相当于(C)分析HaCaT细胞中Smad3的去磷酸化。(E) 冈田酸(OA)对转化生长因子β依赖性Smad2/3磷酸化的影响。如(C)所示,用TGFβ1和SB431542处理HaCaT细胞;在单独的细胞组中,在TGFβ前3.5小时添加5 nM OA,并继续进行TGFβ和SB431542治疗(共8小时)。此处(折线图)和图S2A中给出了相对P-Smad2/3水平的图形分析。值是三个独立实验的平均值;误差线是平均值的±标准偏差。(F) OA对TβRI(T204D)诱导Smad2/3磷酸化的影响。HaCaT细胞在200 moi时感染AdTβRI(T204D)腺病毒。48小时后,用5μM SB431542处理细胞。在添加SB431542之前3.5小时添加5纳米摩尔OA,并与SB431542.保持一致。此处(线形图)和图S2B中给出了相对P-Smad2/3水平的图形分析。数值和误差条是三个独立实验的平均值和标准偏差。
图2
图2。PPM1A脱磷Smad2和Smad3
(A) 通过PPM1A对Smad2进行脱磷。在转染的293T细胞中,Flag-Smad2被抗Flag免疫沉淀,通过Western blotting检测P-Smad2和总Smad2的水平。(B) PPM1A使293T细胞中的Smad3去磷酸化。(C) PPM1A降低内源性P-Smad2/3水平。用PPM1A转染HaCaT细胞,用TGFβ处理(2 ng/ml,1小时),并用抗PPM1A(德克萨斯红)和P-Smad2或P-Smad3(FITC)进行免疫染色。箭头表示PPM1A转染细胞中P-Smad2/3减少。(D) Smad2脱磷需要PPM1A的催化活性。(E) 在MG-132存在下,Smad2脱磷酸化发生。Flag-PPM1A或His-PPM1A与PPM1A一样有效。(F) PPM1A使P-Smad2 MH2结构域(P-S2MH2)去磷酸化。P-S2MH2脱磷需要20 mM Mg2+(车道2),并被40 mM EDTA(车道4)废除。装载等量的半合成重组P-S2MH2(100 ng,1-4通道)和重组PPM1A(100 ng、2-4通道)。(G) PPM1A对Smad2的脱磷依赖于20 mM Mg2+(车道3),但不是2 mM Mn2+(车道4)或20 mM Ca2+(车道5)。(H) λ磷酸酶(λPPase)对Smad2进行去磷酸化。(一) PPM1A特异性地去磷酸化SXS基序,但不去磷酸化Smad3的pS212。连接蛋白磷酸酶特异性地去磷酸化pS212,但不去磷酸化SXS基序。
图3
图3。PPM1A与Smad2相互作用
(A) Flag-PPM1A和HA-Smad2在293T细胞中的免疫共沉淀。免疫沉淀;IB,Western blotting;WCL,全细胞裂解物。(B) 内源性PPM1A-Smad2相互作用是TGFβ诱导的。用TGFβ1处理HaCaT细胞(1小时),用抗PPM1A(第5和第6道)或对照小鼠抗体(第4道)对细胞裂解物进行IP处理。(C) Smad2(V398R)突变体在293T细胞中与PPM1A相互作用。(D) PPM1A和Smad2在HaCaT细胞中的亚细胞共定位。使用抗Smad2(FITC)和抗PPM1A(德克萨斯红)抗体检测Smad2和PPM1A蛋白。DNA用DAPI染色。(E) PPM1A主要定位于细胞核。左:用TGFβ1处理的HaCaT细胞(2 ng/ml,1小时)在分馏和Western blotting分析之前与甲醛交联(补充数据)。C、 细胞质组分;N、 核分数。右:NIH 3T3细胞。(F) PPM1A与Smad2/3的直接相互作用。通过抗PPM1A Western blotting检测到纯化的重组His-PPM1A或His-D239N蛋白与重组GST-Smad2(通道4和7)或Smad3(通道5和8)结合,但不单独与GST结合(通道3和6)。(G) PPM1A仅与P-Smad2结合。Western blotting检测到与重组His-PPM1A蛋白结合的重组Smad2 MH2(aa 241–467)、磷酸化(通道1)或非磷酸化(路径2)。
图4
图4。PPM1A调节Smad的磷酸化、齐聚和核输出
(A) 293T细胞中的特异性PPM1A敲除。Flag-hPPM1A、Flag-taged human PPM1A;旗子-zPPM1A,旗子-斑马鱼PPM1A;h、 shPPM1A494抗人PPM1A;m、 shmPPM1A494对抗小鼠PPM1A。P-Smad2水平与PPM1A水平呈负相关。(B) 减少HaCaT-shPPM1A细胞中Smad2/3去磷酸化。左图:用转化生长因子β和SB431542处理细胞,并如图1C所示进行分析。右:折线图,显示三个独立克隆的P-Smad2/3相对于总Smad2/3的相对水平,每个克隆有两个实验,数值和误差条代表平均偏差和标准偏差。(C) qRT-PCR分析PPM1A(PPM1A)shPPM1A细胞中的mRNA。数值和误差条表示两个实验的平均值和标准偏差(每个实验有三份)。(D) 稳定的PPM1A耗竭增加Smad2磷酸化以及与Smad4的关联。用TGFβ(2 ng/ml,1小时)处理HaCaT-shPPM1A或对照细胞。对细胞核和细胞质级分(补充数据)进行抗Smad4-IP和蛋白质印迹。(E) PPM1A耗竭增加了Smad2在细胞核中的积累。用TGFβ处理细胞1小时,然后用SB431542处理细胞0.5、1、2或4小时。用抗Smad2抗体(FITC)观察Smad2。显示DAPI(DNA染色)和合并。(F) 野生型PPM1A(WT)而非D239突变型(DN)会导致Smad2/3-Smad4分离。(G) PPM1A促进Smad2的核出口。使用了基于MS2的核转运分析系统定量分析(补充数据)。数值和误差条代表三个实验的平均值和标准偏差。
图5
图5。PPM1A缺失促进TGFβ信号转导
(A) PPM1A的缺失增强了HaCaT细胞中TGFβ的抗增殖反应。shPPM1A细胞和对照细胞的DNA合成由[H] 胸腺嘧啶掺入试验。数值和误差条表示两个实验的平均值和标准偏差。(B) 增强的表达第15页通过qRT-PCR评估shPPM1A细胞。数值和误差条表示两个实验的平均值和标准偏差(同样适用于以下所有qRT-PCR分析)。(C) 增加第15页shPPM1A细胞中的启动子活性。数值和误差条表示至少三个实验的平均值和标准偏差(以下所有报告分析也是如此)。(D) qRT-PCR分析第21页在HaCaT细胞中。(E) p38、PI3K和GSK3的抑制剂对第21页mRNA。在TGFβ处理和RNA分析之前,用p38激酶抑制剂(10μM SB202190)、PI3K(10μM LY294002)和GSK3(2μM SB216763)处理细胞3小时。(F) Smad2/3介导了基础和诱导的第21页启动子活性。pSRG-shS2/3同时表达shSmad2和shSmad3。pSRG是一个空向量。(G) c的qRT-PCR分析-myc公司在HaCaT细胞中。(H) qRT-PCR分析PAI-1型在HaCaT细胞中。(一) 增加PAI-1型shPPM1A细胞中的启动子活性。(J) qRT-PCR分析FN公司在HaCaT细胞中。(K) PPM1A不影响GAPDH公司mRNA水平。
图6
图6。PPM1A的诱导表达导致TGFβ抵抗
(A) 通过PPM1A的诱导表达降低Mv1Lu细胞中Smad2/3的磷酸化。用(+)或(-)10 ng/ml多西环素(Dox)培养稳定携带Flag-PPM1A的Mv1Lu-tet-off细胞。左:Flag-PPM1A的诱导表达(7–12车道)。用TGFβ预处理细胞30分钟(通道2和8),然后用SB431542预处理指定时间段(通道3–6和9–12)。Western blotting检测P-Smads、总Smads和PPM1A的水平。右:折线图表示来自两个稳定克隆的数据,每个克隆有两个实验,数值和误差条表示平均值和标准偏差。(B) PPM1A引起部分TGFβ抵抗。Mv1Lu-PPM1A细胞培养±Dox,用不同剂量的TGFβ处理[H] 胸腺嘧啶掺入分析DNA合成。(C) PPM1A阻断TGFβ抗增殖反应。培养的Mv1Lu-PPM1A细胞(±Dox)和处理的±TGFβ(0.2 ng/ml,12小时)进行PCNA染色(Zymed)。对PCNA阳性(黑色)和阴性(浅灰色)细胞进行计数和绘图。(D) PCNA染色的代表性领域,如(C)所示。(E) qRT-PCR分析PAI-1型在Mv1Lu细胞中。数值和误差条表示两个实验的平均值和标准偏差。(F) PPM1A抑制PAI-1型启动子活性。左:用p800-luc转染稳定的Mv1Lu细胞,并用(+)或不使用(-)Dox生长。右图:用p800-luc和PPM1A表达质粒瞬时转染HaCaT细胞。数值和误差条表示至少三个实验的平均值和标准偏差。
图7
图7。斑马鱼胚胎中PPM1A的功能
(A) 24 hpf(受精后小时)活胚胎的侧视图。右图:胚胎注射300 pg第1a页mRNA。眼睛用箭头表示。(B) 胚胎腹视图如(A)所示。请注意,眼睛(箭头)在ppm1a(磅/平方英寸)-注射胚胎。(C–E)胚胎注射400 pgppm1a(磅/平方英寸)mRNA导致全球供应链屏蔽中的表达式(C),损失全球供应链在弦前板(D)中的表达,以及左侧2表达域(心脏)位于右侧24 hpf(E)。胚胎为背视图,动物极点位于顶部(C和D)或头部腹视图(E)。(F–M)注射5 ng S2MH2蛋白的胚胎在24 hpf时表现出头部增大(G和K)和/或尾部丢失(G和L)。与400 pg的ppm1a(磅/平方英寸)mRNA使大多数胚胎在24 hpf(H和M)时发育出异常尾巴。统计数据如(I)所示。(N–Q)全球供应链盾牌阶段的表情。注射5 ng S2MH2和/或400 pg S2MH2的胚胎背视图ppm1a(磅/平方英寸)mRNA显示。请注意全球供应链-S2MH2的诱导作用被以下物质抵消ppm1a(磅/平方英寸).(R–U)全球供应链在芽期表达。实验与(N)–(Q)中的相似。(V和W)的统计数据全球供应链表达式如(N)–(U)所示。根据胚胎的变化程度对其进行分类全球供应链表达分为四类:正常、减少、丢失(弦前板丢失)和扩张。

中的注释

  • 磷酸酶控制受体调节Smad的命运。
    Schilling SH、Datto MB、Wang XF。 Schilling SH等人。 单元格。2006年6月2日;125(5):838-40. doi:10.1016/j.cell.2006.05.015。 单元格。2006 PMID:16751094 审查。
  • PPM1A作为Smad磷酸酶终止TGFβ信号传导。
    Lin X、Duan X、Liang YY、Su Y、Wrighton KH、Long J、Hu M、Davis CM、Wang J、Brunicardi FC、Shi Y、Chen YG、Meng A、Feng XH。 Lin X等人。 单元格。2016年4月7日;165(2):498. doi:10.1016/j.cell.2016.03.038。 单元格。2016 PMID:27058669 没有可用的摘要。
  • PPM1A作为Smad磷酸酶终止TGFβ信号传导。
    Lin X、Duan X、Liang YY、Su Y、Wrighton KH、Long J、Hu M、Davis CM、Wang J、Brunicardi FC、Shi Y、Chen YG、Meng A、Feng XH。 Lin X等人。 单元格。2016年9月8日;166(6):1597. doi:10.1016/j.cell.2016.08.062。 单元格。2016 PMID:27610577 没有可用的摘要。

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