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.2006年4月；26(8):3282-94.
doi:10.1128/MCB.26.8.3282-3294.2006。

热休克转录因子4b与细胞外信号调节激酶丝裂原活化蛋白激酶和双特异性酪氨酸磷酸酶DUSP26的关联和调节

胡延忠 1, 纳希德·米维奇
附属公司

热休克转录因子4b与细胞外信号调节激酶丝裂原活化蛋白激酶和双特异性酪氨酸磷酸酶DUSP26的关联和调节

胡延忠等。 分子细胞生物学. 2006年4月.

摘要

热休克转录因子（Hsfs）激活应激诱导的热休克蛋白（Hsps）和其他分子伴侣的表达，以应对应激，因此在蛋白质解聚和蛋白质折叠中发挥重要作用。在人类中，hsf4基因的错义突变会导致白内障，靶向性破坏hsf4的小鼠表现出晶状体纤维细胞分化和早期白内障形成的缺陷。在这里，我们发现Hsf4b是丝裂原活化蛋白（MAP）激酶胞外信号相关激酶（ERK）的直接靶标，ERK对Hsf4b的磷酸化导致Hsf4b结合DNA的能力增加。令人惊讶的是，Hsf4b还与一种ERK特异性双特异性酪氨酸磷酸酶DUSP26相互作用，该磷酸酶是从酵母双杂交筛选中鉴定出来的。当激活的ERK磷酸化Hsf4b时，DUSP26控制ERK的活性，导致Hsf4b磷酸化/去磷酸化，改变其结合DNA的能力。因此，DUSP26与Hsf4b的相互作用将该转录因子置于MAP激酶信号通路的调节电路中。

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数字

图1。
图1。
一种与Hsf4b相互作用的双特异性酪氨酸磷酸酶的鉴定。（A） 融合到pSos-Hsf4b诱饵质粒的全长Hsf4bcDNA的示意图，用于分离Hsf4b-相互作用蛋白的双杂交筛选。DBD是DNA结合域；HRA/B是氨基末端疏水性七肽重复序列。DHR位于其他Hsf中存在的C-末端疏水性七肽重复序列（HR/C）的下游，但在Hsf4中缺失（34，47）。下面板：显示Hsf4b与DUSP26相互作用的酵母双杂交屏幕。第一行：含有pSos-Hsf4b和pMyr-DUSP26的酵母。第二行：含有pSos-MafB和pMyr-MafB的酵母（阳性对照）。第三行：含有pSos和pMyr-cDNA文库的酵母（阴性对照）。半乳糖诱导pMyr质粒编码的蛋白质的表达。这里使用的酵母菌株在Sos的酵母同源物中包含一个温度敏感突变。引入带有膜定位肉豆蔻酰化蛋白的Sos融合蛋白可在37°C下拯救细胞生长。（B） DUSP26和其他DSP中保存的签名图案用阴影/下划线表示。（C） DUSP26结构，表明它含有羧基末端催化结构域，并且缺少CH2域（43）。还介绍了迄今为止确定的少数DSP的结构，以供比较。（D） 体内表达的GST-Hsf4b与Flag-DUSP26相互作用。表达Flag-DUSP26的H1299细胞裂解液与表达全长GST-Hsf4b或缺失突变体的细胞裂解液培养。GST下拉产物在SDS-PAGE上溶解，并使用Flag抗体进行免疫印迹，以检测DUSP26（上面板）。下部面板显示用于下拉实验的表达结构体1至4的裂解物的免疫印迹。β-肌动蛋白的表达作为对照。（E） GST-DUSP26通过体外下拉试验与Hsf4b相互作用。使用纯化的GST-DUSP26蛋白（通道1）或GST（通道2）从表达Hsf4b的H1299细胞的细胞裂解液中下拉Hsf4b。上面的面板显示免疫印迹实验，以检测GST-DUSP26拉下的Hsf4b。中间面板显示用于下拉分析的表达Hsf4b的细胞裂解物的免疫印迹（IB）和作为负荷控制的β-肌动蛋白。下部面板显示纯化GST-DUSP26和GST蛋白的考马斯蓝染色。（F） Hsf4b和DUSP26在体内相互作用。用EGFP、DUSP26-EGFP融合蛋白或Flag-Hsf4b瞬时共转染H1299细胞。使用来自表达编码EGFP和Flag-Hsf4b质粒的对照细胞的细胞裂解液（通道1）或使用Flag抗体表达编码DUSP26-EGFP和Flag-Hsf4b的质粒的细胞（通道2）进行协同免疫沉淀实验。使用EGFP抗体检测DUSP26-EGFP。通道3和通道4分别使用表达DUSP26-EGFP或EGFP的细胞裂解液中的EGFP抗体进行免疫印迹。下图显示Flag-Hsf4b在细胞裂解物中的表达。
图2。
图2。
DUSP26具有磷酸酶活性。（A） 使用15微克细菌表达和纯化的GST-DUSP26或GST-DUSPS26（C152A）突变体，在37°C孵育0至60分钟（15）后，测定对pNPP的磷酸酶活性。在405-nm波长下对显色反应进行定量。对照反应也单独使用缓冲液或GST进行。（B） 反应条件与面板A相同，但向每个反应混合物中添加0、2.5、5或15μg GST-DUSP26或GST-DUSPS26-C152A融合蛋白，并在37°C下培养30分钟。（C）纯化GST或GST融合蛋白的考马斯蓝染色。通道1仅净化GST。车道2为净化野生型GST-DUSP26。巷3是纯化的GST-DUSP26，带有C152A突变。
图3。
图3。
Hsf4b在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化。（A） 使用Flag-Hsf4b、HA-DUSP26或β-actin抗体通过免疫印迹分析表达空载体或Flag-Hsf4b的H1299细胞裂解物以及编码HA-DUSB26的不同数量质粒。（B） Hsf4b是一种苏氨酸磷酸化蛋白。在用0至100μM钒酸钠处理2 h之前，用Flag-Hsf4b瞬时转染H1299细胞。使用抗Flag抗体对Flag-Hsf4b进行免疫沉淀（500μg裂解物），并用Flag-Hsf4b、磷酸苏氨酸或磷酸酪氨酸的抗体进行可视化，如图所示。β-肌动蛋白表明使用了等量的细胞裂解物进行免疫沉淀。（C） 用含有Flag-Hsf4b的质粒瞬时转染H1299细胞，并与含有HA-DUSP26的质粒共转染或不共转染。代谢标记3小时后3237°C时为P，32使用Flag抗体从等量的细胞裂解液中免疫沉淀P-Flag-Hsf4b，并制备免疫沉淀材料，用于在没有（左侧面板）或存在（右侧面板）共表达HA-DUSP26的情况下进行磷酸分析。磷酸化苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸的位置用箭头表示。下面板：免疫印迹实验显示Flag-Hsf4b（第1和第2道）和HA-DUSP26在细胞裂解液中的表达。当Hsf4b与DUSP26（车道2）共存时，其数量通常较低（脱磷）。β-肌动蛋白表示每条泳道中有等量的细胞裂解物。（D） DUSP26影响Hsf4b与HSE的结合。将H1299细胞与Flag-Hsf4b和越来越多的HA-DUSP26共同转染（与A组1至4区的样本相同）。48小时后，用EMSA分析10μg细胞裂解液。通道5与通道1中的细胞裂解物相同，加上Flag抗体，以显示Hsf4b的超位移。细胞裂解物中表达的蛋白质的表达如图A所示。
图4。
图4。
Hsf4b不是DUSP26去磷酸化的直接靶点。用编码Flag-Hsf4b的质粒瞬时转染H1299细胞，并用32在37°C下放置4小时。32使用Flag抗体对P-Hsf4b进行免疫沉淀，其中一组作为对照组（通道1），第二组在25°C下与免疫沉淀Flag-DUSP26在体外培养30分钟（通道2）。通过SDS-PAGE分析混合物，并将凝胶暴露在X射线胶片上进行检测32P-Hsf4b（上面板）。通过免疫印迹法对分离的级分进行Flag分析，以检测免疫沉淀的Hsf4b或DUSP26。请注意32上部面板中Hsf4b加DUSP26样本中的P计数减少了两倍，但与下部面板中免疫印迹检测到的免疫沉淀Hsf4b中的两倍减少（1150 cpm对490 cpm）成正比。
图5：。
图5：。
Hsf4b在体外被MAP激酶家族成员磷酸化。（A和B）免疫复合物激酶分析。用含有Flag-DUSP26或组成活性Mek的（+）或（−）质粒瞬时转染H1299细胞以激活ERK1/2。转染后48小时，对ERK1进行免疫沉淀，并使用Hsf4b（残基196-493）作为底物进行免疫复合物激酶分析。（B） 免疫印迹显示所用细胞裂解液中内源性（上带）和表达（下带）Mek、ERK1/2和Flag-DUSP26的表达。通道1至3对应于面板A和B中的相同样本。（C和D）免疫复合物激酶分析。如图所示，使用或不使用含有Flag-DUSP26的质粒瞬时转染H1299细胞。转染后48小时，将细胞置于37°C或45°C下30分钟以激活JNK1。JNK1经免疫沉淀后用于免疫复合物激酶分析，使用纯化的GST-Jun或GST-Hsf4b作为底物。用磷酸化JNK1抗体、总JNK1抗体或Flag抗体对C组细胞裂解物进行免疫印迹，以检测DUSP26（D）。通道1至4对应于面板C和D中的相同样本。
图6。
图6。
MAP激酶信号通路激活后，Hsf4b结合HSE的能力发生改变。（A） 用含有Flag-Hsf4b的质粒瞬时转染H1299细胞。48小时后，用添加0.5%血清的培养基预处理细胞20小时，然后用培养基加10%血清处理细胞20分钟以激活ERK1/2，或用茴香霉素（20μg/ml）或7 mM山梨醇处理细胞20 min以分别激活JNK或p38。使用Flag抗体进行免疫印迹检测Hsf4b。β-肌动蛋白被用作等负荷的对照。（B） 用含有Flag-Hsf4b的质粒瞬时转染H1299细胞，并用含有HA-DUSP26或Mek的质粒共同转染（+）以激活ERK1/2。在EMSA中使用细胞裂解物检测Hsf4b与HSE的结合能力（上面板），或在免疫印迹分析中使用Flag抗体检测Hsf4 b（下面板）。上部面板中的车道1至4对应于下部面板中的通道1至4。上部面板中的通道5、6和7与通道1相同，但细胞裂解物分别在存在Hsf1、Flag-Hsf4或Hsf2抗体的情况下培养20分钟，以确认Hsf4b对HSE的特异性。
图7。
图7。
ERK1/2和DUSP26与Hsf4b相互作用。（A） Hsf4b在体内与内源性ERK1/2相互作用。用含有HA-Hsf4b的质粒瞬时转染H1299细胞，并使用无一级抗体（第1道）或HA抗体（第2道）进行免疫沉淀，免疫沉淀材料在SDS-PAGE上分离，并使用ERK1/2抗体进行免疫印迹（顶面板）。总ERK1/2和表达的HA-Hsf4b也显示为对照（下两个面板）。（B） GST-Hsf4b和ERK1/2的体内下拉。将含有GST-Hsf4b缺失突变体或仅含GST的质粒瞬时转染H1299细胞（1至5）。转染后48小时，细胞裂解物受到GST下拉，下拉部分使用ERK1/2抗体进行免疫印迹（上面板）。使用ERK1/2抗体对用于GST下拉的细胞裂解物进行免疫印迹（下面板）。泳道1至5显示Hsf4b缺失构建体和单独用于GST下拉的GST。（C） 体内拉下GST-Hsf4b片段的野生型和突变型，该片段包含结合HA-ERK1的区域2和区域3。如图所示，用含有GST-Hsf4b野生型或突变片段的质粒瞬时转染H1299细胞，并与HA-ERK1共转染。转染后48小时，对细胞裂解物进行GST下拉，并使用HA抗体对下拉组分进行免疫印迹以检测ERK1（上图）。中间和下部面板显示细胞裂解物的免疫印迹，以分别显示HA-ERK1、GST单独或使用HA或GST抗体的GST融合蛋白的表达。通道1至6对应于所有面板，显示细胞（+）中表达的质粒和下拉中存在的蛋白质。（D） 体内下拉GST-Hsf4b、HA-ERK1和Flag-DUSP26。如图所示，用含有GST单独或野生型或突变型GST-Hsf4b片段的质粒瞬时转染H1299细胞，并用HA-ERK1和Flag-DUSP26共同转染。在转染后48小时，细胞裂解物进行GST下拉，并使用HA抗体对下拉部分进行免疫印迹，以检测ERK1（上面板）、Flag抗体检测DUSP26（中面板）或GST抗体检测GST单独或GST融合蛋白（下面板）。通道1至5显示GST单独和GST下拉实验中使用的Hsf4b缺失结构。细胞裂解物的免疫印迹显示不同组中HA-ERK1和Flag-DUSP26的表达，作为对照（下面板）。
图8。
图8。
Hsf4b与ERK1和DUSP26相互作用。用仅含GST或GST-Hsf4b（196至493）的质粒瞬时转染H1299细胞，并与编码HA-ERK1和Flag-DUSP26的质粒共同转染。转染后48小时，使用Flag-DUSP26抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀实验（左面板）。免疫沉淀蛋白用HA抗体检测ERK1或GST抗体检测GST或GST-Hsf4b进行免疫印迹。右侧面板显示细胞裂解物的免疫印迹，以分别使用HA、Flag或GST抗体检测HA-ERK1、Flag-DUSP26和GST或GST-Hsf4b的表达。车道1、2和3表示左右面板中的相同组。
图9：。
图9：。
Hsf4b和DUSP26在小鼠脑内共存。（A） 从所示组织中制备cDNA，并使用Hsf4b、DUSP26或HPRT特异性引物进行PCR扩增（20个周期）。（B） 使用30μg从小鼠全脑或原代星形胶质细胞培养物制备的细胞裂解液进行免疫印迹实验。使用DUSP26、Hsf4b或β-肌动蛋白抗体对膜进行印迹。（C） 使用来自面板B的相同细胞裂解物检测内源性DUSP26和Hsf4b之间的相互作用。使用Hsf4b抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并使用DUSP26抗体进行印迹。这些实验进行了三次，结果一致。IgG、免疫球蛋白G。（D）小脑石蜡包埋切片的免疫组织化学染色，显示DUSP26、Hsf4-EGFP（小鼠靶向敲除）（33）、神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）（星形胶质细胞特异性）和NeuN（神经元特异性）的内源性表达，使用适当的抗体。箭头表示Hsf4b、DUSP26和NeuN可能共存的区域。（E） 大鼠出生后第0天的原代皮层神经元培养物生长3天；然后用4%多聚甲醛固定细胞，并使用NeuN和Hsf4b抗体或NeuN与DUSP26进行免疫染色。细胞核用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。由于Hsf4b和DUSP26的抗体均为兔多克隆抗体，因此未对Hsf4b+DUSP26进行联合免疫染色。然而，几乎所有的NeuN阳性细胞都用Hsf4b和DUSP26进行了免疫染色（右面板）。
图9。
图9：。
Hsf4b和DUSP26在小鼠脑内共存。（A） 从所示组织中制备cDNA，并使用Hsf4b、DUSP26或HPRT特异性引物进行PCR扩增（20个周期）。（B） 使用30μg从小鼠全脑或原代星形胶质细胞培养物制备的细胞裂解液进行免疫印迹实验。使用DUSP26、Hsf4b或β-肌动蛋白抗体对膜进行印迹。（C） 使用来自面板B的相同细胞裂解物检测内源性DUSP26和Hsf4b之间的相互作用。使用Hsf4b抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并使用DUSP26抗体进行印迹。这些实验进行了三次，结果一致。IgG、免疫球蛋白G（D）小脑石蜡包埋切片的免疫组织化学染色，显示DUSP26、Hsf4-EGFP（靶向敲除小鼠）（33）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（星形胶质细胞特异性）和NeuN（神经元特异性）的内源性表达。箭头表示Hsf4b、DUSP26和NeuN可能共存的区域。（E） 大鼠出生后第0天的原代皮层神经元培养物生长3天；然后用4%多聚甲醛固定细胞，并使用NeuN和Hsf4b抗体或NeuN与DUSP26进行免疫染色。细胞核用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。由于Hsf4b和DUSP26的抗体均为兔多克隆抗体，因此未对Hsf4b+DUSP26进行联合免疫染色。然而，几乎所有的NeuN阳性细胞都用Hsf4b和DUSP26进行了免疫染色（右面板）。
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