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.2005年4月5日;102(14):5138-43.
doi:10.1073/pnas.0501675102。 Epub 2005年3月24日。

Foxp3与活化T细胞的核因子和NF-kappa B相互作用,抑制辅助T细胞的细胞因子基因表达和效应功能

附属公司

Foxp3与活化T细胞的核因子和NF-kappa B相互作用,抑制辅助T细胞的细胞因子基因表达和效应功能

埃斯特尔·贝泰利等。 美国国家科学院程序. .

摘要

缺乏功能性Foxp3的Scurfy小鼠表现出严重的淋巴增生性疾病,并表现出细胞因子的普遍过度生产。这里,我们表明,在Foxp转录因子家族(包括Foxp1、Foxp2和Foxp3)中,只有Foxp3能够抑制初级T辅助细胞产生IL-2、IL-4和IFN-gamma。我们发现Foxp3与Rel家族转录因子、活化T细胞核因子(NFAT)和NF-kappaB存在物理关联,并阻断其诱导靶基因(包括关键细胞因子基因)内源性表达的能力。更重要的是,与来自WT小鼠的T细胞相比,来自皮屑鼠的T细胞的活化T细胞核因子(NFAT)和NF-kappa B转录活性显著增加。此外,皮屑衍生T细胞中Foxp3的互补性将NFAT和NF-kappa B转录活性降低到生理水平。最后,我们发现用Foxp3转导的髓磷脂蛋白特异性自身反应性T细胞不能介导实验性自身免疫性脑脊髓炎,进一步支持Foxp3抑制自身反应性T细胞的效应器功能。Foxp3已经与CD4(+)CD25+调节性T细胞的生成相关;我们的数据还表明,Foxp3通过直接抑制两个关键转录因子NFAT和NF-kappa B的活性来抑制T辅助细胞的效应器功能,这两个转录因子对细胞因子基因表达和T细胞功能至关重要。

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数字

图1。
图1。
Foxp3,而不是其他Foxp家族成员,抑制T细胞中的细胞因子表达。将Foxp1、Foxp2、Foxp3或Foxp3 cDNA的缺失突变体(编码所示氨基酸)插入RV GFP逆转录病毒载体。这些载体利用内部核糖体进入位点(IRES)同时表达GFP的特定Foxp cDNA。用抗CD3和抗CD28刺激纯化的T细胞,并在人IL-2的存在下感染Foxp表达或对照逆转录病毒。GFP+感染后48小时对T细胞进行分类。感染后一周,GFP+-感染的CD4+用抗原提呈细胞(照射过的脾细胞)和可溶性抗CD3抗体刺激T细胞。该图表示IL-2的量(A类D类),IL-4(B类)和干扰素-γ(C类)通过ELISA测定,分泌在这些活化细胞的培养上清液中。
图2。
图2。
Foxp3抑制NF-κB转录活性并抑制NF-κB靶基因A20的内源性表达。(A类C类)将所示质粒、NF-κB荧光素酶报告子和Tk转染293T细胞-雷尼利亚作为内部控制的记者。20小时后(当用TNF-α刺激细胞时再增加6小时),用双荧光素酶分析法对细胞进行分析,在正常化后测定相对活性雷尼利亚.(B类)用Foxp3转染293T细胞,48小时后用TNF-α刺激1小时或用P65和Foxp3联合转染,用EMSA评估NF-κB DNA结合活性。(D类)用所示质粒转染293T细胞,转染后48小时,通过实时PCR检测内源性A20的表达。
图3。
图3。
Foxp3抑制NFAT转录活性并抑制内源性IL-4的产生。(A类)用指示的表达质粒和IL-4萤光素酶报告基因瞬时转染M12细胞。转染后,一半转染细胞培养24小时,并检测荧光素酶活性。(B类)另一半细胞培养72小时,并对上清液进行IL-4检测。结果代表了三个独立的实验。293T电池(C类)或Jurkat细胞(D类)转染NFATp、组成活性NFATp(NFAT-CA)或pcDNA3载体对照(Vec.)以及或不转染Foxp3,如图所示。在所有情况下,NFAT荧光素酶报告者和TK-雷尼利亚使用了报告人(作为内部控制)(参见材料和方法). 20小时后,通过双荧光素酶分析法对细胞进行分析,用标准化后测定相对活性雷尼利亚. (D类)如上所示瞬时转染Jurkat细胞,并在用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐(PMA)和离子霉素(P/I)刺激6小时后通过双荧光素酶分析进行分析。
图4。
图4。
Foxp3和REL蛋白NFATp和NF-κB之间的物理联系及其反式激活域的阻遏。(A类)将P65或P65-GFP与Myc-Foxp3或对照载体瞬时转染293T细胞,并使用抗Myc单克隆抗体进行免疫沉淀。蛋白质在SDS/PAGE上运行,用兔抗P65多克隆抗体进行免疫印迹以检测免疫沉淀物,并用抗P65或抗Myc抗体检测裂解物。(B类)用RV对照或RV-HA-Foxp3转导293T细胞,用TNF-α刺激1h,用抗HA单克隆抗体免疫沉淀,用兔抗P65多克隆抗体免疫印迹检测免疫沉淀和裂解产物。(C类)将HA标记的NFAT-CA或RSK2与Myc-Foxp3或对照载体瞬时转染293T细胞,并使用抗Myc单克隆抗体进行免疫沉淀。用兔抗HA多克隆抗体进行免疫印迹,检测免疫沉淀物和裂解物。(D类)用Gal4荧光素酶报告子和Gal4 DNA-结合域、Gal4-P65、Gal4-NFAT、Gal4 KRC或Gal4-ELK1转染293T细胞,转染或不转染Foxp3。20小时后,收集细胞并分析荧光素酶活性,如材料和方法.
图5。
图5。
功能性Foxp3的缺失导致NF-κB和NFAT过度激活。美国国家足球协会(A类)和NF-κB(B类)在原发性CD4中评估荧光素酶活性+来源于WT scurfy小鼠(Scurf.)的T细胞或转染Foxp3并用抗CD3和抗CD28激活24小时的scurfyT细胞(C类)或者来自皮屑鼠(D类)用Gal4萤光素酶报告基因连同Gal4 DNA结合结构域、Gal4-P65、Gal4-NFAT或Gal4-ELK1转染,并用抗CD3和抗CD28活化。20小时后,收集细胞并分析荧光素酶活性,如材料和方法.
图6。
图6。
Foxp3对体内CD4的效应器功能+T细胞。(A类)CD4细胞+纯化PLP特异性TCR转基因小鼠的T细胞,用PLP139-151激活,并感染RV或RV-Foxp3逆转录病毒。CD4细胞+GFP公司+然后从RV-或RV-Foxp3-感染的细胞中分选,并通过以下方法测试其对PLP肽的增殖反应H公司。数据表示增殖反应±SE(B类)该图表示通过ELISA测定的这些活化细胞培养上清液中分泌的IL-2和IFN-γ的量。(C类)GFP公司+-分选的PLP特异性T细胞(5×106)将感染RV或RV-Foxp3的小鼠注射到RAG缺陷小鼠体内。随着时间的推移,对EAE的进展进行了跟踪,并将其作为各组的平均临床疾病。

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