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.2005年3月23日；24(6):1157-69.
doi:10.1038/sj.emboj.7600608。 Epub 2005年3月10日。

通过ARF肿瘤抑制因子激活ATR和Chk1调节NF-kappaB和p53

索尼娅·罗查 1, 米歇尔·加勒特, 基斯汀·坎贝尔, 凯蒂·舒姆, 尼尔·D·珀金斯
附属公司

通过ARF肿瘤抑制因子激活ATR和Chk1调节NF-kappaB和p53

索尼娅·罗查等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

ARF肿瘤抑制因子是细胞防御癌基因激活的核心成分。除了通过结合Mdm2激活p53外，ARF还具有其他功能，包括抑制抗凋亡RelA（p65）NF-kappaB亚单位的转录活性。在这里，我们证明ARF诱导了苏氨酸505处RelA转录激活域的ATR和Chk1依赖性磷酸化，这是ARF依赖性抑制RelA基因转录活性所需的位点。与此效应一致，ARF诱导的对肿瘤坏死因子α诱导的细胞死亡的敏感性需要ATR和Chk1。值得注意的是，ARF诱导的p53活性和增殖抑制也需要ATR活性。ARF通过激活ATR和Chk1实现这些效果。此外，ATR及其支架蛋白BRCA1（而非Chk1）重新定位到特定的核仁位点。这些结果揭示了ARF、ATR和Chk1的新功能以及调节RelA NF-kappaB功能的新途径。此外，该途径提供了一种机制，通过该机制ARF可以重塑细胞对致癌挑战的反应，并执行其作为肿瘤抑制剂的功能。

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数字

图1
图1
ARF对NF-κB活性的抑制依赖于ATR和Chk1。(A、 B类)靶向ATR和Chk1的siRNA可消除ARF诱导的Bcl-xL抑制。用指定的siRNA处理NARF2-E6细胞后，进行Bcl-xL表达的PCR分析。用IPTG处理细胞以诱导ARF表达（A）或用UV-C（40 J/m）刺激细胞2)（B）。(C、 D类)抑制ATR或Chk1活性可消除ARF介导的对Bcl-xL启动子的抑制。总之，将1.5μg Bcl-xL或Bcl-xLΔκB荧光素酶报告质粒转染到NARF2-E6细胞中。如所示，共转染（C）1μg kdATR或kdChk1表达质粒，或如诱导ARF时所示，用2 mM咖啡因或1μM gö6976处理（D）细胞。在本次和随后的荧光素酶分析中，结果表示为相对于相关未经处理的细胞对照中的水平的折叠激活或抑制。在本图和后续图中，由于某些数据点的分辨率低于图形的分辨率，因此没有误差线。本图和后续图中的所有数据点均来自至少三个独立实验。(E、 如果)Chk1是ARF介导的RelA转录激活结构域的抑制所必需的。将Gal4 E1B萤光素酶报告质粒（1μg）与编码单独Gal4（0.75 ng）或Gal4 RelA（TAD）（0.75 ng）的表达质粒一起转染到NARF2-E6细胞中。如有指示，在ARF诱导（D）时，细胞也被1μg激酶死亡显性阴性Chk1表达质粒（E）共转染或用1μM gö6976处理。
图2
图2
ARF诱导的对TNF诱导的细胞死亡的敏感性需要ATR和Chk1。用对照、ATR和Chk1 siRNA（寡核苷酸A和B组合）转染NARF2 E6细胞一次。在siRNA转染后48小时，用IPTG处理细胞以诱导ARF。再过24小时，用TNF（30 ng/ml）处理细胞，24小时后，如前所述测定细胞死亡百分比（Rocha等, 2003).
图3
图3
Thr505下RelA的磷酸化。(A类)ARF诱导Thr505磷酸化。从NARF2细胞制备全细胞裂解物，用IPTG处理诱导ARF 24小时，用TNF刺激（10 ng/ml，30分钟）或不处理。然后通过将150μg裂解液与纯化的磷酸化RelA T505A抗体孵育来免疫沉淀磷酸化的RelA。免疫沉淀物在用抗RelA抗体（sc-372 Santa Cruz）进行免疫印迹之前通过SDS-PAGE溶解。(B类)紫外线不会诱导Thr505磷酸化。除了用100μg核蛋白提取物进行免疫沉淀外，实验按（A）进行。输入通道代表10μg核提取物。如图所示，用UV-C（40 J/m）处理一些细胞2)并在显示的时间后收获。(C类)Chk1抑制剂Gö6976阻止ARF诱导的Thr505磷酸化。实验按照（A）进行，但这表明细胞在添加IPTG的同时与1μM Gö6976孵育。(D类)示意图显示了RelA-Thr505区域的物种保护以及与Chk1一致性磷酸化序列的相似性。人类Thr505残留物下划线。(E类)RelA Thr505基序被Chk1磷酸化在体外纯化的GST、GST RelA TAD（氨基酸428–551）和GST Rel A TAD T505A与重组纯化的GST-Chk1和未标记的ATP孵育。然后通过SDS–PAGE解析蛋白质，并用抗磷酸RelA Thr505抗体进行免疫印迹（上面板）。用抗GST抗体进行免疫印迹显示GST-RelA（TAD）和GST-Rel A TAD（T505A）蛋白的载量相等（下表）。(F类)ARF诱导核磷酸化-Thr505-modified RelA。将NARF2细胞镀在盖玻片上，并在IPTG处理后的指定时间固定。用小鼠抗p14抗体对细胞进行染色农业研究基金和兔抗P-T505 RelA抗体。在这个和随后的实验中，使用DeltaVision显微镜分析细胞并获取图像。(G公司)在Hs68 E2F1–ER细胞中诱导RelA Thr505磷酸化。除了用300μg来自Hs68 E2F1–ER细胞的全细胞裂解物进行免疫沉淀外，与（A）中一样进行实验。输入通道代表30μg提取物。如图所示，用三苯氧胺和2 mM咖啡因处理细胞，24小时后收获。
图4
图4
ARF诱导的p53激活需要ATR。(A类)ARF诱导ATR与p53的关联。用200μg由按指示处理的NARF2细胞制备的全细胞裂解物免疫沉淀ATR。免疫沉淀复合物通过SDS-PAGE溶解，并用抗p53和抗ATR抗体进行免疫印迹。(B类)ARF诱导的p53转录活性需要ATR。总之，1.5μg p53依赖性PG13荧光素酶和p21WAF1（加权平均1）荧光素酶报告质粒转染NARF2细胞。如有指示，用1μg kdATR表达共同转染细胞。(C、 D类)咖啡因治疗可消除ARF诱导的p53。全细胞裂解物的Western blot分析显示，在含有或不含2 mM咖啡因的情况下，用IPTG或Hs68 E2F1–ER细胞处理NARF2细胞后，ARF、p53和p21的诱导。(E、 F类)ATR siRNA治疗抑制ARF诱导的p53活性。NARF2（E）或Hs68 E2F1–ER（F）细胞全细胞裂解物的Western blot分析显示ARF、p53和p21的诱导。用ATR或对照siRNA转染细胞。(G公司)ATM siRNA治疗并不能消除NARF2细胞中p53的ARF诱导。NARF2细胞全细胞裂解物的Western blot分析显示，在ATM或对照siRNAs治疗后，ARF、p53和15-磷酸修饰的p53被诱导。在顶部面板中，ATM RNA水平的PCR分析显示了ATM siRNA处理后的情况。ATM siRNA对ATM蛋白表达的抑制如补充图1G所示。(H（H）)ATM siRNA在DNA损伤后抑制p53激活。全细胞裂解物的Western blot分析显示，在用2μM阿霉素处理NARF2细胞4小时后，用ATM或对照siRNAs处理的NARF细胞中诱导了p53和磷酸-硒15-修饰的p53。
图5
图5
ARF诱导的细胞增殖抑制需要p53和ATR。用指示的siRNA寡核苷酸转染NARF2细胞，48小时后，用IPTG诱导ARF。如阿拉玛蓝试验所示，每24小时测量一次细胞增殖。结果来自一式三份的四个单独实验。
图6
图6
ARF诱导ATR活性。(A类)ARF诱导ATM/ATR底物磷酸化。用IPTG处理NARF2细胞，诱导ARF 24 h，用UV-C（40 J/m）刺激，制备全细胞裂解物2)或未经治疗。然后用SDS–PAGE溶解裂解产物（20μg），并用抗磷酸-SQ/TQ抗体进行蛋白质印迹。(B类)内源性ARF诱导Hs68 E2F1–ER细胞ATR活性。用三苯氧胺处理Hs68 E2F1–ER细胞24小时后，使用抗磷酸-SQ/TQ抗体对全细胞裂解物进行Western blot分析。如图所示，用ATR（A，B联合）、ARF（A，B联合）或对照siRNA转染细胞两次。ARF siRNA验证如补充图1H所示。
图7
图7
ARF诱导Chk1磷酸化。从经IPTG处理的NARF2细胞制备全细胞裂解物，以诱导ARF达到指定时间，并用UV-C（40 J/m）刺激2)或未经治疗。
图8
图8
向含ARF的核仁复合物招募ATR和BRCA1。(A、 B类)ARF诱导后ARF、ATR和BRCA1的免疫荧光分析。将NARF2细胞镀在盖玻片上，并在IPTG处理后的指定时间固定。用兔抗p14抗体对细胞进行染色农业研究基金山羊抗ATR抗体和小鼠抗BRCA1抗体。在（B）中，对选定的数据进行了进一步分析，并通过检查合并和放大的图像来确定指示蛋白质的共定位。由于这些都是数字图像，因此在此图像和所有后续图像中的颜色指定是任意的。(C类)ATR与ARF共同免疫沉淀。从NARF2细胞制备的150μg全细胞裂解物中免疫沉淀ARF。免疫沉淀复合物通过SDS-PAGE溶解，并用抗ARF或ATR抗体进行免疫印迹。(D类)E2F诱导的ARF与ATR共定位。Hs68 E2F-ER细胞ARF和ATR的免疫荧光分析。三苯氧胺处理24小时后，将细胞贴在盖玻片上并固定。用兔抗p14抗体对细胞进行染色农业研究基金和山羊抗ATR抗体。合并的ATR/ARF图像的放大部分也显示出来。
图9
图9
ARF诱导的p53激活需要BRCA1。NARF2全细胞裂解物的蛋白质印迹分析显示ARF、p53、磷酸丝氨酸15-p53和p21的诱导。细胞用ATR（寡聚物A和B组合）、BRCA1或对照siRNA双重转染。BRCA1 siRNA验证如补充图1I所示。
图10
图10
ARF诱导后Chk1定位和ATR相关性分析。(A类)ARF不招募Chk1到核仁。ARF诱导24 h后固定NARF2细胞，并用山羊抗ATR、兔抗ARF和羊抗Chk1进行染色。显示合并Chk1/ATR图像的放大部分。(B类)ARF诱导后，ATR与Chk1共免疫沉淀。从150μg NARF2细胞制备的全细胞裂解物中免疫沉淀ATR，无论是否诱导ARF。免疫沉淀复合物通过SDS-PAGE溶解，并用抗Chk1和抗ATR抗体进行免疫印迹。
图11
图11
丝氨酸15-磷酸化p53定位于ARF和含ATR的核仁复合物。(A类)ARF诱导后p53的免疫荧光分析。用小鼠抗p53 DO1抗体对NARF2细胞进行p53染色。(B类)UV-C治疗后丝氨酸15-磷酸化p53的成像。UV-C（40 J/m）作用4h后U-2 OS细胞丝氨酸15-磷酸化p53的免疫荧光分析2). 用小鼠16G8抗磷酸丝氨酸15 p53单克隆抗体对细胞进行染色。(C类)丝氨酸15-磷酸化p53与核仁中的ARF和ATR相关。NARF2细胞ARF诱导后ARF、ATR和丝氨酸15-磷酸化p53的免疫荧光分析。用兔抗p14抗体对细胞进行染色农业研究基金山羊抗ATR单克隆抗体和小鼠16G8抗磷胺15 p53单克隆抗体。补充数据中可以看到其他图像。
图12
图12
描述ARF参与ATR/Chk1通路的示意图模型。本报告中的数据表明，ARF通过两种不同于DNA损伤后的途径参与ATR。在核质中，Chk1被ATR激活，是RelA NF-κB亚单位Thr505磷酸化所必需的。这抑制了RelA反式激活，导致Bcl-xL水平降低，使细胞对凋亡刺激敏感。在核仁，ARF诱导ATR/BRCA1复合物的组装，该复合物似乎是丝氨酸15激活p53所必需的。核质ATR/BRCA1也可能有助于p53激活。此外，这两种途径都可能调节许多其他细胞过程，并对ARF介导的肿瘤抑制做出更广泛的贡献。
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  • p53在椎间盘退变中的新作用及其治疗意义。
    Wang Y，Hu S，Zhang W，Zhang B，Yang Z。 王毅等。 细胞死亡发现。2023年12月1日；9(1):433. doi:10.1038/s41420-023-01730-5。 细胞死亡发现。2023 PMID：38040675 免费PMC文章。 审查。
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    Mechetin GV，扎尔科夫DO。 Mechetin GV等人。 基因（巴塞尔）。2023年1月2日；14(1):127. doi:10.3390/genes1400127。 基因（巴塞尔）。2023 PMID：36672868 免费PMC文章。 审查。
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    1. Abraham RT（2001）通过ATM和ATR激酶的细胞周期检查点信号。基因Dev 15:2177–2196-公共医学
    1. Bartek J，Lukas J（2003）检查点控制和癌症中的Chk1和Chk2激酶。癌细胞3:421–429-公共医学
    1. Bertwistle D、Sugimoto M、Sherr CJ（2004）Arf抑癌蛋白与核磷蛋白/B23的物理和功能相互作用。分子细胞生物学24:985–996-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Brookes S、Rowe J、Ruas M、Llanos S、Clark PA、Lomax M、James MC、Vatcheva R、Bates S、Vousden KH、Parry D、Gruis N、Smit N、Bergman W、Peters G（2002）INK4a缺乏的人二倍体成纤维细胞对RAS诱导的衰老具有抵抗力。EMBO J 21：2936–2945-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Budde A，Grummt I（1999）p53抑制核糖体基因转录。癌基因18:1119-1124-公共医学

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