Mapping residues of SUMO precursors essential in differential maturation by SUMO-specific protease, SENP1

doi:10.1042/BJ20041210

.2005年3月1日；386（第2部分）：325-30。

doi:10.1042/BJ20041210。

利用SUMO特异性蛋白酶SENP1对SUMO前体进行差异成熟所必需的残基定位

郑旭¹, 香农W N金

附属公司

PMID： 15487983
预防性维修识别码：项目经理1134797
内政部： 10.1042/BJ20041210

利用SUMO特异性蛋白酶SENP1对SUMO前体进行差异成熟所必需的残基定位

郑旭等。生物化学杂志. 2005.

.2005年3月1日；386（第2部分）：325-30。

doi:10.1042/BJ20041210。

作者

郑旭¹, 香农W N金

附属

¹香港沙田香港中文大学理学院生物化学系。

PMID： 15487983
预防性维修识别码：项目经理1134797
内政部： 10.1042/BJ20041210

摘要

SUMO（小型泛素相关修饰物）是泛素样蛋白家族的一员，调节多种靶蛋白的细胞功能。SUMO蛋白以其前体形式表达。在成熟过程中，SUMO特异性蛋白酶在这些前体的“GG”区域后裂解残基是后续sumoylation的先决条件。为了进一步了解这种蛋白水解过程，我们使用大肠杆菌表达系统表达并纯化了SENP1（sentrin-specific protease 1），它是SUMO特异性蛋白酶之一。我们发现SENP1能够在体外处理所有SUMO-1、-2和-3；然而，SUMO-1的蛋白水解效率最高，其次是SUMO-2和-3。我们进一步证明，SENP1（SENP1C）的催化结构域可以单独决定对SUMO-1、-2和-3的底物特异性。将SUMO-1和-2前体的“GG”区域后的C末端片段替换为SUMO-3前体的G末端片段，表明C末端片段对有效成熟至关重要。在诱变分析中，我们进一步绘制了紧邻“GG”区域的两个残基，这两个残基可确定差异成熟度。SENP1、SUMO-1、-2和-3的组织分布模式不同。综上所述，我们认为所观察到的差异成熟过程在sumoylation途径的调节中具有生理意义。

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数字

**图1。人SUMO-1、-2和-3的多蛋白序列比对**
显示了SUMO-1、-2和-3的序列。完全保守的残基用黑体表示，“GG”裂解位点用方框表示。

**图2。SENP1水解SUMO-1、-2和-3融合蛋白**
(A类)通过SDS/PAGE分析部分纯化的SENP1。(B类)SUMO-1、-2和-3成熟反应的SDS/PAGE分析。纯化的His-SUMO-1、-2和-3–GST融合物（0.1 nM）与2μg部分纯化的SENP1在37°C的50μl反应混合物中孵育20分钟。控制（−）反应不含SENP1。培养后，对每种反应混合物的12μl进行SDS/PAGE分析。(C类)SENP1的蛋白水解活性如所示(B类)使用抗-His抗体进行免疫印迹分析。

**图3。SENP1在SUMO成熟中的底物特异性**
使用不同量的SENP1（2、0.4和0.08μg）在37°C的50μl反应混合物中水解0.1 nM的His-SUMO-1、-2和-3–GST融合物20分钟。培养后，对12μl反应混合物进行SDS/PAGE分析。

**图4。SENP1C与SENP1具有相同的底物特异性**
(A类)用SDS/PAGE分析纯化的SENP1C。(B类)SUMO成熟过程中SENP1C的底物特异性。使用不同量的SENP1C（0.2、0.05、0.01和0.002μg）在37°C的50μl反应混合物中水解0.1 nM His-SUMO-1、-2和-3–GST融合物20分钟。培养后，对12μl反应混合物进行SDS/PAGE分析。

**图5。SENP1的底物特异性由SUMO蛋白的尾部赋予**
分析尾部对成熟效率的影响。(A类)示意图显示了通过交换“GG”解理位点后的尾部来构建嵌合体SUMO-1M、-2M和-3M。只显示了尾部的蛋白质序列。(B类)SENP1（2和0.4μg）和(C类)将SENP1C（0.2和0.01μg）添加到含有0.1 nM SUMO-1M、-2M或-3M的分析混合物中。反应在37°C的50 ml混合物中培养20分钟。培养后，用SDS/PAGE分析12μl反应混合物。对照（-）反应不含SENP1或SENP1C。

**图6。SUMO蛋白尾部的第一和第二氨基酸在SUMO成熟反应中很重要**
(A类)示意图显示了基于SUMO-2的突变。“GG”切割位点为黑体。*，突变的位置。(B类)不同SUMO突变体对SUMO成熟的SDS/PAGE分析。将SENP1C（0.01μg）添加到反应混合物中，并按照图5（B）和实验部分所述进行实验。控制（−）反应不含SENP1C。

**图7。SENP1、SUMO-1、-2和-3的组织分布**
使用标准化人类MTC™面板I和II（BD Biosciences）作为模板，通过PCR分析SENP1、SUMO-1、-2和-3的组织分布。PCR按照实验部分所述进行。SENP1、SUMO-1、-2和-3的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上按相同的序列分离：通道1，胸腺；车道2，肾脏；3巷，肺；第4车道，前列腺；第5车道，胰腺；6巷，脾；第7车道，肝脏；8巷，白细胞；泳道9，大脑；10巷，胎盘；11巷，睾丸；第12车道，冒号；泳道13，卵巢；14巷，小肠；15号车道，心脏；16号跑道，肌肉。用溴化乙锭对琼脂糖凝胶染色检测结果。

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