Degradation of promoter-bound p65/RelA is essential for the prompt termination of the nuclear factor kappaB response

doi:10.1084/jem.20040196

.2004年7月5日；200(1):107-13.

doi:10.1084/jem.20040196。 Epub 2004年6月28日。

启动子结合的p65/RelA的降解对于迅速终止核因子-κB反应至关重要

西蒙娜·萨卡尼¹, 伊万·马拉齐, Amer A Beg（阿梅尔·A乞丐）, 乔亚奇诺·纳托利

附属公司

PMID： 15226358
预防性维修识别码： PMC2213320型
内政部： 10.1084/jem.20040196

启动子结合的p65/RelA的降解对于迅速终止核因子-κB反应至关重要

西蒙娜·萨卡尼等。实验医学杂志. 2004.

.2004年7月5日；200(1):107-13.

doi:10.1084/jem.20040196。 Epub 2004年6月28日。

作者

西蒙娜·萨卡尼¹, 伊万·马拉齐, Amer A Beg（阿梅尔·A乞丐）, 乔亚奇诺·纳托利

附属

¹瑞士贝林佐纳6500 Via Vela 6生物医学研究所。

PMID： 15226358
预防性维修识别码： PMC2213320型
内政部： 10.1084/jem.20040196

摘要

核因子（NF）-kappaB/Rel家族的转录因子在IkappaBs降解后转位到细胞核。NF-kappaB活性的诱导后抑制依赖于NF-kampaB调节的IkappaBalpha的再合成，后者将NF-kapbaB从DNA中分离出来并将其输出到细胞溶质。我们发现激活后，p65/RelA被细胞核中的蛋白酶体降解，并以DNA结合依赖的方式进行降解。如果蛋白酶体活性被阻断，尽管IkappaBalpha重新合成并发生持续转录，但NF-kappaB并没有从一些靶基因中迅速去除。这些结果表明，p65/RelA的蛋白酶体降解不仅调节其稳定性和丰度，而且积极促进转录终止。

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数字

**图1。**
IκBα缺陷细胞NF-κB反应的终止。（A） WT和IκBα中NF-κB下调的动力学^−/−3T3细胞。如指示的那样，用TNF-α刺激细胞，并使用典型κB位点作为探针（5′-AGTTGAG）通过电泳迁移率变化分析（EMSA）分析NF-κB结合活性**GGGACTTTCC公司**CAGGC-3′）。使用磷光成像仪对数据进行量化。还显示了IκBα降解和再合成的动力学。（B）蛋白酶体抑制防止IκBα中NF-κB下调^−/−细胞。TNF-α洗脱后，用β内酯孵育细胞并用EMSA测定。细胞质和细胞核提取物上显示了抗p65蛋白印迹（W.B.）。（C）内源性p65在NF-κB活化后泛素化。IκBα提取物^−/−用抗p65抗体免疫沉淀细胞，用抗泛素单克隆抗体印迹。H.C.，重型链条。（D）通过共同转染FLAG-p65和myc-ubiquitin表达载体在HEK-293T细胞中重建p65泛素化。用抗p65多克隆抗体和抗myc单克隆抗体检测从全细胞提取物中获得的印迹。（E） IκBα^−/−用TNF刺激细胞15分钟，清洗，并用10 ng/ml LMB孵育3.15小时。在核裂解物上进行EMSA。作为LMB效应的阳性对照，显示了IκB激酶复合物α在LMB处理细胞的核部分中的积累。

**图2。**
p65泛素化需要序列特异性结合到κB位点。（A）用NH克隆了WT p65和一个在Rel同源域（23Y>A；26E>D）中具有双重取代的p65突变体₂-末端GFP标记并单独或用p50表达载体转染HEK-293细胞。以典型κB位点为探针，制备总裂解产物并用EMSA进行分析。GFP标签允许在p65同源二聚体和p65/p50异源二聚体之间进行容易的区分（未说明，非特异性）。抗p65免疫印迹显示内源性p65和转染GFP-p65在总裂解物中的表达。还显示了IκBα的表达。（B） WT和突变GFP-p65与p50和IκBα的关联。如图所示转染293T细胞。用抗p50或抗IκBα抗体免疫沉淀总细胞提取物，然后用抗p65抗体印迹。（C） κB位点结合缺陷型p65突变体不能有效地进行多泛素化。HEK-293T与所示表达载体共转染。通过抗p65免疫印迹测定全细胞提取物中p65的高分子量泛素化形式的出现。（D） p65诱导蛋白酶体成分向靶基因募集。用空载体或FLAG-p65表达载体转染HEK-293细胞。使用抗FLAG抗体、抗Sug1抗体或对照抗体进行ChIP分析。显示了FLAG-p65和Sug1向内源性IκBα基因启动子的招募。（E）用TNF-α刺激HEK-293细胞进行抗p65和抗Sug1 ChIP检测。免疫沉淀DNA用跨越IκBα启动子或IκBα基因下游区域的引物扩增。

**图3。**
IκBα缺陷细胞中蛋白酶体的抑制决定了持续的启动子占用和NF-κB依赖性转录活性的增加。（A） TNF-α刺激的IκBα中的抗p65 ChIP^−/−细胞。脉冲TNF后的β-内酯治疗延长了所有测试靶基因的占用，并诱导（B）增加和维持转录。（C）蛋白酶体抑制增加TNF-α刺激的IκBα中荧光素酶报告子的κB位点定向转录^−/−细胞。

**图4。**
蛋白酶体抑制对IκBα阳性细胞NF-κB反应终止的影响。（A）蛋白酶体抑制损害WT 3T3细胞核NF-κB活性的下调（EMSA测定）。还显示了IκBα的降解和再合成。（B）用β内酯或载体处理TNF刺激的WT 3T3细胞的抗p65 ChIP测定和mRNA分析（C）。显示了β内酯处理对p65的IP-10和MIP-2占用及其转录活性的影响。（D）蛋白酶体抑制对NIH3T3细胞NF-κB反应下调和靶基因（E）p65占用的影响。

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1. Verma、I.M.、J.K.Stevenson、E.M.Schwarz、D.Van Antwerp和S.Miyamoto。1995年。Rel/NF-κB/IκB家族：关联和分离的亲密故事。基因发育9:2723–2735。-公共医学
1. Baldwin，A.S.，Jr.1996年。NF-κB和IκB蛋白质：新发现和新见解。每年。免疫学评论。14:649–683.-公共医学
1. 怀特塞德、S.T.和A.以色列。1997年。IκB蛋白：结构、功能和调节。塞明。癌症生物学。8:75–82.-公共医学
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