Regulation of alternative splicing by SRrp86 and its interacting proteins

doi:10.1128/MCB.23.21.7437-7447.2003

.2003年11月；23(21):7437-47.

doi:10.1128/MCB.23.21.7437-7447.2003。

SRrp86及其相互作用蛋白对选择性剪接的调控

李军（Jun Li）¹, 伊恩·霍金斯, 克里斯托弗·德·哈维, 詹妮弗·詹宁斯, 安德鲁·J·林克, 詹姆斯·巴顿

附属公司

PMID： 14559993
预防性维修识别码： PMC207616型
内政部： 10.1128/MCB.23.21.7437-7447.2003

SRrp86及其相互作用蛋白对选择性剪接的调控

李军（Jun Li）等。分子细胞生物学. 2003年11月.

.2003年11月；23(21):7437-47.

doi:10.128/MCB.23.21.7437-747.2003。

作者

李军（Jun Li）¹, 伊恩·霍金斯, 克里斯托弗·德·哈维, 詹妮弗·詹宁斯, 安德鲁·林克, 詹姆斯·巴顿

附属

¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学生物科学系，邮编37235。

PMID： 14559993
预防性维修识别码： PMC207616型
内政部： 10.1128/MCB.23.21.7437-7447.2003

摘要

SRrp86是SR蛋白超家族的一个独特成员，包含一个RNA识别基序和两个富含丝氨酸-精氨酸（SR）的结构域，这些结构域被一个不寻常的富含谷氨酸-赖氨酸（EK）的区域分隔开。此前，我们发现SRrp86可以通过正向和负向调节其他SR蛋白的活性来调节选择性剪接，并且独特的EK结构域可以抑制组成型和选择性剪接。这些功能与SRrp86通过与靶蛋白相互作用从而调节靶蛋白活性而发挥作用的模型最为一致。为了鉴定与SRrp86相互作用的特定蛋白质，我们使用酵母双杂交文库筛选和免疫沉淀耦合质谱。我们发现SRrp86与所有核心SR蛋白以及其他剪接调控蛋白的子集相互作用，包括SAF-B、hnRNP G、YB-1和p72。与之前显示SRrp86激活SRp20的结果相反，我们现在显示SAF-B、hnRNP G和9G8都拮抗SRrp86的活性。总之，我们得出的结论是，SRrp86不仅调节SR蛋白的活性，而且反过来也受其他剪接因子的调节，以控制选择性剪接位点的选择。

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数字

**图1。**
SRrp86相关蛋白的免疫共沉淀。用10μg空Flag载体或面板A中显示的不同Flag标记SRrp86结构转染HEK 293T细胞。24小时后收集细胞，用抗Flag M2结合琼脂糖珠免疫沉淀约850μg总细胞裂解物，并在含有100 mM KCl的低盐缓冲液中洗涤。蛋白质在8M尿素中洗脱，并在15%SDS凝胶上溶解。（B）将5微克总细胞裂解物（左侧）和三分之一的结合蛋白（右侧）溶于15%SDS凝胶上，并用考马斯蓝染色。箭头标记过度表达的结构和抗Flag IgG链的位置。请注意，Flag-SRrp86ΔRS与IgG轻链相结合。左侧的值是标记（车道MW）的大小，单位为千吨。（C）三分之一的洗脱液用抗SRp20的单克隆抗体进行Western blot分析。抗Flag IgG链被二级抗体识别，因为它们来自小鼠。

**图2。**
SRrp86与SAF-B、hnRNP G、YB-1、p72或9G8之间的体外相互作用。表位标记的SRrp86是通过将TAP标记（47）融合到SRrp86的羧基末端而创建的。该标签由一个钙调蛋白结合肽和两个IgG结合位点组成，这两个结合位点来自由烟草蚀刻病毒蛋白酶位点分离的蛋白a。就我们的目的而言，只使用了IgG结合位点。从杆状病毒感染的Hi5细胞中纯化TAP标记的SRrp86，并用指示的³⁵S标记蛋白。通过IgG偶联琼脂糖珠传代捕获相关蛋白。结合蛋白在SDS凝胶上洗脱和分析。作为对照，在玻璃体翻译的荧光素酶中也与SRrp86-TAP孵育，并为每个反应单独测定与珠子的背景结合。

**图3。**
SRrp86在体内激活CD44 v5内含物。（A）小鼠CD44基因（顶部）和CD44 v5小基因（底部；RSV，Rous肉瘤病毒；MCS，多克隆位点；SV40 poly-A，猴病毒40多聚腺苷化位点）示意图。箭头表示启动子的位置，箭头表示PCR引物的位置。（B）将越来越多的SRrp86 cDNA与CD44 v5小基因共转染到COS7细胞中。拼接产物通过RT-PCR进行分析，在6%变性凝胶上分离，并通过磷光成像仪分析进行定量。v5夹杂物的增加如下图所示。外显子跳跃和内含物产物如右图所示。（C）与B组一样，在转染COS7细胞中检测增加SRrp86ΔEK和SRrp86△RS数量对v5内含物的影响。

**图4。**
SAF-B、hnRNP G和9G8在促进v5纳入方面对抗SRrp86。（A至D）将越来越多的所示构建物与CD44 v5小基因共同转染到COS7细胞中，并按照图3的图例所述分析v5内含物。显示了具有代表性的凝胶，通过多次独立转染实验确定了v5包合物的增加。

**图5：。**
SRrp86激活E1A小基因的远端5′剪接位点。（A） E1A小基因包含三个可选的5′剪接位点和一个常见的3′剪接部位，用于生成9S、12S和13S mRNA，如图所示。（B）越来越多的SRrp86 cDNA与E1A小基因共转染，剪接产物通过RT-PCR分析，在6%变性凝胶上分离，并通过荧光成像仪分析定量。右边的数值表示腺病毒E1a mRNA的沉降值。面板C显示了9S mRNA和12S/13S比率的增加。

**图6。**
9G8对抗SRrp86。（A） HeLa细胞转染E1A小基因和200 ng指定结构。通过RT-PCR分析剪接产物，在6%变性凝胶上分离，并通过磷成像仪分析进行定量。12S/13S mRNA比率的倍数增加在面板B中绘制，9S mRNA的增加在面板C中显示。平均值和标准偏差由多个独立转染实验确定。

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