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.2003年10月6日;198(7):1043-55.
doi:10.1084/jem.20031023。 Epub 2003年9月29日。

LPS-TLR4向IRF-3/7和NF-kappaB发送信号涉及收费适配器TRAM和TRIF

附属公司

LPS-TLR4向IRF-3/7和NF-kappaB发送信号涉及收费适配器TRAM和TRIF

凯瑟琳·菲茨杰拉德等。 实验医学杂志. .

勘误表in

  • 《实验医学杂志》,2003年11月3日;198(9):1450年之后

摘要

Toll-IL-1抗性(TIR)域包含适配器诱导干扰素-β(TRIF)相关适配器分子(TRAM)是第四种参与Toll受体信号传导的TIR域包含适配器蛋白。与TRIF一样,TRAM激活干扰素调节因子(IRF)-3、IRF-7和NF-kappaB依赖的信号通路。Toll样受体(TLR)3和4激活这些通路以诱导IFN-α/β、调节激活、正常T细胞表达和分泌(RANTES)以及γ-干扰素诱导蛋白10(IP-10)的表达,这些表达独立于衔接蛋白髓样分化因子88(MyD88)。本文进行的显性阴性和siRNA研究表明,TRIF在TLR3(dsRNA)和TLR4(LPS)信号通路的下游发挥作用,而TRAM的功能仅限于TLR4通路。TRAM与TRIF、MyD88适配器样蛋白(Mal)/TIRAP和TLR4相互作用,但不与TLR3相互作用。这些研究表明,TRIF和TRAM都在LPS-TLR4信号传导中发挥作用,在对LPS的先天免疫反应中调节MyD88依赖性通路。

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数字

图1。
图1。
LPS和dsRNA激活IRF-3和IRF-7。(a) 用LPS(0.1–100 ng/ml)、Malp-2(5 nM)和dsRNA(1–100μg/ml)刺激来自WT和MyD88缺陷小鼠的BM衍生巨噬细胞12 h。用ELISA测定RANTES的浓度。(b) 从用LPS(10 ng/ml)、Malp-2(5 nM)和dsRNA(50μg/ml)刺激1 h的WT和MyD88缺陷巨噬细胞中分离出核提取物,并使用EMSA进行处理32P标记的ISRE共识序列(ISG-15)作为探针。通过放射自显影术观察活化复合物。在与ISRE探针孵育之前,将活化的ISRE DNA结合复合物与IRF-3的多克隆抗体或两种对照抗体预孵育(右)。(c) 用荧光素酶报告基因转染表达TLR3和TLR4/MD2的HEK293细胞系,该报告基因含有镀锌4上游激活序列和Gal4-DBD、Gal4-IRF-3、,Gal4–IRF-7(40纳克)。24小时后,用LPS(10 ng/ml)、dsRNA(50μg poly-IC/ml)、IL-1β(10 ng/ml)刺激细胞,或不治疗约8小时,并测量荧光素酶报告基因活性。
图2。
图2。
TRAM激活IRF-3和IRF-7。(a) TRAM、TRIF、MyD88和Mal的TIR域与TLR1、TLR2、TLR3和TLR4对齐。氨基酸颜色基于其物理化学性质,其中黄色=小,绿色=疏水,绿松石色=芳香,蓝色=带正电,红色=带负电。(b) 如图1c所示转染HEK293细胞,并与40 ng TRAM或TRIF共转染。24 h后,测量荧光素酶报告基因活性。
图3。
图3。
TRAM通过IKKɛ和TBK1与IRF-3和CBP相互作用并发出信号。(a) 将表达IRF-3–GFP–的HEK293细胞接种在35-mm的玻璃底部无菌组织培养皿上,并瞬时转染1μg标记的TRAM、TRIF或pCDNA3.1,24小时后通过共焦显微镜观察。(b) 如图所示,用4μg Flag-TRAM转染293T细胞,其中含有或不含有编码IRF-3(未标记)的质粒。24小时后,用抗IRF-3、抗Flag或抗CBP免疫沉淀全细胞裂解物,并对免疫沉淀复合物进行标记TRAM和IRF-3的免疫印迹。还分析了全细胞裂解物(WCL)中的标记蛋白。(c) 将RANTES荧光素酶报告基因和TRAM(20 ng)转染HEK293细胞,并在10、20、30、40、60和80 ng的浓度范围内,增加IKKɛ-k38a、TBK1-k38a-或IRF3-ΔN的浓度,共同转染细胞。转染24 h后测量荧光素瘤报告基因活性。
图4。
图4。
TRAM介导通向IRF-3和IRF-7的TLR4途径。(a) 用40 ng RANTES报告基因结构转染HEK293细胞,并与TRAM、TRAM-TIR、TRAM-C113H或TRAM-P112H共转染镀锌4上游激活序列与共转染Gal4–DBD,Gal4-IRF-3,或Gal4–IRF-7或RANTES荧光素酶报告基因以及TRAM-C113H或TRIF-ΔNΔC。第二天,用LPS(10 ng/ml)或dsRNA(50μg/ml poly-IC)刺激细胞或不治疗约8小时,并测量荧光素酶报告基因活性。
图5。
图5。
TRAM激活NF-κB并对TLR4通路具有特异性。(a) HEK293细胞转染40 ngNF公司-κB类报告人构建并与TRAM、TRAM-TIR、TRAM-C113H和TRAM-P112H共转染NF公司-κB类报告基因和TRAM-C113H浓度增加的共转染。转染后1 d,用Malp-2(2 nM)、dsRNA(100μg/ml poly-IC)、LPS(10 ng/ml)、R-848(10μM)、IL1β(10 ng/ml)或TNFα(10 ng/ml)刺激TLR-表达细胞或不治疗或8 h,并测量荧光素酶报告基因活性。
图6。
图6。
TRAM信号需要TRIF的表达。(a)用RANTES荧光素酶报告基因TRAM或TRIF(40 ng)转染HEK293细胞,并用TRIF-ΔNΔC或TRAM-C113H共同转染。24小时后测定荧光素酶报告基因活性。(b) 用4μg TRAM-CFP或TRIF-CFP转染293T细胞,并与Flag-Mal、Flag-Mal-P125H或Flag-TRIF共转染。48 h后收集全细胞裂解物,并用抗GFP抗体(也可免疫沉淀蓝荧光蛋白[CFP]或黄荧光蛋白[YFP])免疫沉淀。免疫沉淀复合物通过SDS-PAGE溶解,并对标记的适配器进行免疫印迹。全细胞裂解物(WCL)也通过免疫印迹分析CFP-和Flag标记的蛋白质。(c) 稳定TLR4YFP公司-或TLR3YFP公司-用4μg编码Flag-Mal、Flag-TRAM或Flag-TRAM-C113H的质粒转染表达HELA细胞。48小时后,用抗GFP抗体免疫沉淀全细胞裂解物,并用免疫沉淀复合物免疫印迹标记标记适配器。裂解产物的Western blotting显示稳定TLR和转染适配器蛋白的表达。
图7。
图7。
LPS激活RANTES需要TRAM和TRIF。(a) 用1μg编码TRAM-CFP、TRIF-CFP或Mal-CFP的质粒转染24孔板中的293T细胞,并用50 nM siRNA-TRAM或层粘连蛋白a/C共同转染,如图所示。24小时后,用405nm激光激发CFP,用流式细胞仪测定CFP荧光。siRNA-TRAM几乎完全消除了表达CFP的细胞亚群的表达。(b) U373–CD14或TLR3表达的HEK293细胞被转染咆哮报告基因和siRNA双链体共转染36 h。然后用LPS或dsRNA刺激细胞8 h,并测量荧光素酶报告基因活性。

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引用人

工具书类

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