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.2003年8月;14(8):3414-26.
doi:10.1091/mbc.e02-09-0581。 Epub 2003年4月17日。

染色质蛋白高迁移率族盒(HMGB)1和HMGB2与有丝分裂染色体的关联

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染色质蛋白高迁移率族盒(HMGB)1和HMGB2与有丝分裂染色体的关联

Coralie托盘等。 分子生物学细胞. 2003年8月.

摘要

高迁移率族盒(HMGB)1和2是两种丰富的非组蛋白核蛋白,与染色质相关。先前基于免疫荧光分析的研究表明,HMGB1在有丝分裂期间从染色体上分离。在本研究中,使用增强型绿色荧光蛋白和盘状体红色荧光蛋白标记蛋白重新研究HMGB1和2在活细胞中的亚细胞定位。与以前的报道相反,HMGB1和2在有丝分裂细胞中以两种形式存在,即游离并与快速交换的浓缩染色质结合。HMGB2与有丝分裂染色体相互作用的详细分析表明,HMG-box A和B的两个位点负责结合。重要的是,当细胞被渗透或暴露于免疫检测技术中广泛使用的化学固定剂时,这种相互作用会迅速失活。HMG-核小体结合(HMGN)组的两种蛋白质,即HMGN1和HMGN2,也观察到类似的行为。

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图1。
图1。
人HMGB cDNA的克隆。用PCR扩增HMGB1和HMGB2 cDNA来自反向转录的聚腺苷化RNA。所用底漆的位置放大HMGB2由前置传感器上的箭头指示。编号打开方框代表外显子。鉴于检测到HMGB1(车道1)的单个cDNA,HMGB2(车道2)扩增了两个cDNA(hmgb 2.1和hmgb 2.2)。顺序分析表明,hmgb1和hmgb2.1符合预期成熟度mRNA,而hmgb 2.2来源于部分剪接RNA,其中包含外显子3和4之间的内含子(开盒)。
图2。
图2。
HMGB蛋白质与人类和小鼠染色体相互作用。(A) 活的赫拉表达EGFP或组蛋白H1、HMGB2、HMGB1与EGFP融合的细胞(绿色)或荧光显微镜观察DsRed(红色)。DNA被染色Hoechst 33342(蓝色)。然而EGFP不与有丝分裂染色体相互作用,有丝分裂期间H1-EGFP与浓缩染色质严格共定位。HMGB2型与有丝分裂染色体的结合独立于N或EGFP的C端子位置。HMGB2结合在DsRed融合。对HMGB1进行了类似的观察,标记有EGFP或DsRed连接到其N或C端子。(B) HeLa细胞通过编码HMGB1-EGFP的表达载体。在早期至有丝分裂后期。HMGB2也进行了类似的观察(我们的未发布的数据)。(C) 通过表达转染小鼠3T3细胞矢量编码HMGB1-EGFP(绿色)。DNA经Hoechst 33342(蓝色)染色。在活细胞中,HMGB1定位于细胞核,不排除在核仁。它与大多数异染色质区域共定位(黄色箭头)。在副甲醛固定细胞中,HMGB1-EGFP从赫斯特-亮点(红色箭头)并留在核仁中。
图3。
图3。
HMGB2融合到EGFP或DsRed与有丝分裂染色体相互作用8周转染后。用pHMGB2-EGFP或pDsRed-HMGB2,在基因素存在下生长3周,然后在缺少选择。荧光焦点被克隆了3到5次。阳性病灶包含的细胞表达无法检测到的高水平荧光蛋白(顶部,低倍)。在所有情况下,HMGB2-EGFP(g)与有丝分裂的染色体相互作用。克隆得到了类似的结果表达DsRed-HMGB2(d)的HeLa细胞(底部,高倍放大)。DNA是用Hoechst 33342(h)染色。请注意,DsRed-HMGB2仅限同域而HMGB2-EGFP也在细胞质。
图6。
图6。
HMGB缺失突变体的表达和定位。(A) 原理图HMGB2和截断形式的表示。核(N)或细胞质指出了定位(C)及其与有丝分裂染色体的结合。(B) HMGB2和截短型与EGFP(g)融合的细胞定位HeLa细胞。细胞DNA用Hoechst 33342(h)复染。(C)HMGB2、HMGB1和HMGB2的各种缺失突变体的表达融合到EGFP。对10毫克总蛋白提取物进行SDS-PAGE和用针对EGFP的抗体进行Western blot分析。
图4。
图4。
EGFP不会改变HMGB1的已知特性。(A) HMGB1-EGFP泄漏来自渗透细胞。表达HMGB1-EGFP的HeLa细胞被渗透将NP-40直接放在显微镜上,采集序列图像添加洗涤剂前后。少于1.5分钟就足以输掉渗透后HMGB1的全部补体。(B) HMGB1和HMGB1-EGFP在细胞渗透时扩散相似。表达EGFP的HeLa细胞,EGFP-H1或HMGB1-EGFP在PBS和NP40存在下孵育5最小可溶性(S)和不溶性(染色质结合)的当量体积(P)蛋白质通过Western blot分析,使用针对EGFP。然后用一种针对人类的抗体重新制备膜HMGB1。还分析了相当数量的总蛋白(T)。HMGB1和HMGB1-EGFP仅在可溶部分中检测到,表明这两种蛋白质同样从细胞中扩散出来。(C) 与EGFP的融合不损害HMGB1的交易活动。HeLa细胞用定量报告质粒pTHCR和pSGD9转染,以及增加pHMGB1或pEGFP-HMGB1的量。HMGB1和HMGB1-EGFP在瞬时共转染分析中增强HOXD9转录活性。
图5。
图5。
HMGB1的细胞质和染色体相关形式可以快速交换。(A) 有丝分裂细胞胞质区FLIP表达HMGB1-EGFP(a)。圆圈所示区域被反复漂白200ms和细胞在漂白脉冲之间成像。荧光损失是整个细胞快速完整,包括浓缩染色体。HMGB1-EGFP的染色体和细胞质池之间存在互换,蛋白质与浓缩染色质的快速分离。FLIP打开有丝分裂细胞表达EGFP-H1(b)。细胞质区(左侧细胞)和两个有丝分裂细胞的凝聚染色体(右侧细胞)上的一个区域重复漂白200 ms,细胞在漂白剂之间成像脉冲。细胞质中的漂白不会导致染色体,而染色体上的漂白会导致漂白斑附近区域的荧光。(B) FLIP定量表达EGFP-H1或HMGB1-EGFP的活HeLa细胞。
图7。
图7。
HMGB2与有丝分裂染色体结合有两个区域。(A)HMGB2截短型融合子的染色体结合特性分析活HeLa细胞中EGFP(g)。在培养基72小时内观察到细胞转染后。Hoechst 33342(h)对DNA进行了复染。(B) 分析HMGB2衍生物与EGFP融合的染色体结合特性(g)染色体扩散后。HeLa细胞在有丝分裂中被阻滞16小时秋水仙碱治疗。Hoechst对DNA进行了复染33342(小时)。然后对有丝分裂细胞进行低张力休克在显微镜载玻片上进行细胞离心。与有丝分裂染色体结合在没有固定培养基(EGFP和突变株)的情况下立即进行评估B) 或在PBS加20%甘油的情况下。注意,Hoechst染色在没有安装介质的情况下几乎无法检测到。快速结合蛋白质在安装介质中扩散,而结合蛋白的观察时间长达1小时。
图8。
图8。
HMGB与有丝分裂染色体的相互作用被多聚甲醛破坏。表达EGFP或组蛋白H1、HMGB1和HMGB2的HeLa细胞与EGFP融合在含有4%多聚甲醛的PBS存在下培养10分钟。作为治疗开始后1分钟,HMGB蛋白质就分解来自浓缩染色质,而H1-EGFP即使在长时间孵育后。注意,HMGB蛋白在即使在固定细胞中,末期染色体的附近。
图9。
图9。
在活细胞中观察到HMGN1-EGFP与有丝分裂染色体结合,而不是在多聚甲醛处理的细胞中。(A) HeLa细胞通过编码HMGN1的表达载体融合到EGFP(g)的N末端。DNA是由Hoechst 33342(h)复染。72小时后观察到活细胞荧光显微镜转染。HMGN1与有丝分裂相关有丝分裂早期到晚期的染色体。(B) HMGN1绑定到当细胞被含有4%多聚甲醛的PBS(白色箭头)。注意HMGN1集中在副甲醛处理细胞的核仁区。

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