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.2003年9月；23(17):6210-20.
doi:10.1128/MCB.23.17.6210-6220.2003。

BAF60a介导核受体和BRG1染色质重塑复合物之间的关键相互作用以实现反式激活

裴文孝 1, 克里斯蒂·J·傅兰雅, 凯文·沃特罗, 王伟东, 特雷弗·K·阿彻
附属公司

BAF60a介导核受体和BRG1染色质重塑复合物之间的关键相互作用以实现反式激活

裴文孝等。 分子细胞生物学. 2003年9月.

摘要

核激素受体是调控染色质结构的配体依赖性转录调节因子。然而，受体募集染色质重塑活性的确切分子机制尚未完全阐明。我们表明，在缺乏配体结合域的情况下，糖皮质激素受体（GR）能够与体内的核受体辅活化因子和BRG1染色质重塑复合体相互作用。单独而言，GR与BRG1相关因子60a（BAF60a）和BAF57直接相互作用，但与BRG1、BAF155或BAF170无直接相互作用。此外，BAF60a具有至少两个交互表面，一个用于GR和BRG1，另一个用于BAF155和BAF170。GR突变体GR（R488Q）在体外无法与BAF60a相互作用，从而降低了染色质重塑活性，并降低了体内组装为染色质的启动子的转录活性。BAF60a截短突变体BAF60a4-140的稳定表达导致体内染色质特异性GR功能丧失。在BAF60a突变体存在的情况下，GR无法与BRG1复合物相互作用，因此也缺乏从染色质激活转录的能力。因此，除了先前确定的BAF250外，BAF60a可能在核受体和BRG1复合体之间提供另一个关键和直接的联系，这是启动子募集和随后的染色质重塑所必需的。

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数字

图1。
图1。
GR1-556在体内与SRC-1和BRG1复合物相互作用。（A） 用乙醇（−）、地塞米松（Dex）（10−7M） 或R5020（10−8M） 24小时后，通过动力学分析分析细胞裂解液的CAT活性，并用总蛋白标准化。插入物显示GR1-556在2963.1/556细胞中表达，但在表达GRwt的亲代2963.1细胞或A1-2细胞中不表达。（B） SRC-1与2963.1/556细胞中的GR1-556相关。GR1-556相关复合物是从2963.1/556细胞的全细胞提取物中免疫沉淀出来的，无抗体（第3道）或BUGR2抗GR抗体（第4道），并用SRC-1、BRG1、BAF155和GR抗体进行免疫印迹（BUGR2）。SRC-1、BRG1和BAF155的同源输入分别显示在非抗体（no Ab）和抗GR抗体（αGR）免疫印迹的第1和第2道中。（C） GR1-556与SRC-1、SRC-3、BRG1、BAF170、BAF155、BAF60a和BAF57的相互作用。GST和GR融合蛋白用于拉下SRC-1、SRC-3、HDAC1、BRG1和BAF170、155、60a或57。输入裂解物（10%）作为对照。
图2。
图2。
BAF60a连接类固醇激素受体和BRG1复合物。（A） GST和BAF60a融合蛋白用于拉下BRG1、BAF170、BAF155、BAF60b和GR1-556，如图1C的图例所示。相互作用的相对强度在放射自显影图下方显示。（B） 对GR、突变GR（R488Q）、PRb、ERα、FXR、PPARγ1、VDR和RXRα进行了面板A图例中规定的体外下拉分析。在1μM地塞米松（用于GR）和10 nM R5020（PRb）、0.1μM 17β-雌二醇（ERα）、10μM鹅去氧胆酸（FXR）、10µM 15d-前列腺素J2（PPARγ1）、10 nM EB1089（VDR）或10μM 9-顺式维甲酸（RXRα）条件下应用激素，并与不使用激素的载体（−激素）的结果进行比较。（C） 下拉分析中使用的核受体序列比对，以说明DBD中的RRK基序。
图3。
图3。
GR（R488Q）突变体在体外不能与BAF60a相互作用，并且在体内不能激活染色质模板的转录。（A） 用BRG1和MMTV-CAT报告基因转染GRwt和GR（R488Q）至SW-13/M3-2细胞。细胞转染后用乙醇（−）或地塞米松（10−7M） 根据地塞米松诱导，绘制同一细胞裂解液中的CAT和荧光素酶活性。（B） Western blotting检测转染BRG1、GRwt和GR（R488Q）的表达。
图4。
图4。
GR1-556和GR（R488Q）突变体都表现出染色质重塑减少。（A） 通过以下方法检测GRwt、GR（R488Q）或GR1-556刺激的染色质重塑上海我过敏。用BRG1和GRwt、GR（R488Q）或GR1-556转染SW-13/M3-2细胞24小时。用地塞米松（10−7M） （+）或对照（乙醇）（−），并立即通过上海我评估染色质启动子内Nuc-B的超敏反应。（B） 在转染的SW-13/M3-2细胞中，BRG1复合物与GRwt、GR（R488Q）或GR1-556的相互作用通过与来自500μg全细胞提取物的BRG1抗体共免疫沉淀来检测，然后用抗BRG1和GR的抗体进行蛋白质印迹分析。
图5：。
图5：。
BAF60a4-140的表达阻断GR激活。（A） 上面板、UL3细胞和衍生BAF60a4-140表达克隆60N.9、60N.15和60N.17用乙醇（−）或10处理−8M地塞米松（+）24小时后，染色质组装MMTV-荧光素酶的表达被绘制为地塞米森（Dex）诱导UL3细胞活性的百分比。用BAF60a4-64抗体进行免疫印迹，在UL3细胞和BAF60a-4-140衍生克隆的核提取物中检测到下面板、BAF60a和BAF60 a4-140。（B） BAF60a4-140的表达抑制染色质模板的GR激活，但不抑制瞬时模板。将MMTV-CAT质粒转染UL3和60N.17细胞。用地塞米松（10−8M） 使用地塞米松诱导的UL3细胞活性为100%绘制同一细胞裂解液中CAT和荧光素酶活性。（C） 通过以下方法检测UL3和60N.17细胞中MMTV启动子的染色质结构上海乙醇（−）或10治疗后的I超敏反应−8M地塞米松（+）1小时上海每个车道的I超敏反应从右侧面板相对于车道1绘制。误差线表示三次试验的标准偏差。
图6。
图6。
BAF60a4-140抑制GR与BRG1复合物的相互作用。（A） GR与BRG1复合物的相互作用通过与抗BRG1抗体的共免疫沉淀进行检测。用抗BRG1、BAF155、GR和BAF60a的抗体通过蛋白质印迹分析输入（100μg全细胞提取物）和共免疫沉淀的复合物（来自1mg全细胞提取物）。（B） BAF60a4-140抑制GR与BRG1复合物相互作用的模型。BAF60a4-140突变体可单独或与BAF60a结合到BRG1复合物中以生成非功能复合物。或者，BAF60a4-140突变体可直接阻断GR与复合物相互作用的能力。
图6。
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BAF60a4-140抑制GR与BRG1复合物的相互作用。（A） GR与BRG1复合物的相互作用通过与抗BRG1抗体的共免疫沉淀进行检测。用抗BRG1、BAF155、GR和BAF60a的抗体通过蛋白质印迹分析输入（100μg全细胞提取物）和共免疫沉淀的复合物（来自1mg全细胞提取物）。（B） BAF60a4-140抑制GR与BRG1复合物相互作用的模型。BAF60a4-140突变体可单独或与BAF60a结合到BRG1复合物中以生成非功能复合物。或者，BAF60a4-140突变体可直接阻断GR与复合物相互作用的能力。
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