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.2003年3月17日;22(6):1313-24.
doi:10.1093/emboj/cdg139。

丝裂原和应激激活蛋白激酶-1(MSK1)对NF-kappaB p65亚单位的转录激活

附属公司

丝裂原和应激激活蛋白激酶-1(MSK1)对NF-kappaB p65亚单位的转录激活

琳达·弗默伦等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

核因子κB(NF-kappaB)是参与免疫和炎症反应的多种基因转录的关键调节因子之一。长期以来,NF-kappaB活性被认为主要由IkappaB-家族成员调节,通过掩蔽核定位信号,使转录因子复合体在细胞质中保持非活性状态。如今,控制NF-kappaB核转录潜能的其他机制的重要性已被普遍接受。我们发现,有丝分裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580和PD98059或U0126,以及一种有效的有丝分裂素和应激活化蛋白激酶-1(MSK1)抑制剂H89,可以抵消肿瘤坏死因子(TNF)介导的p65反式激活能力的刺激。p65的突变分析显示Ser276是TNF反应中磷酸化和反式激活的靶点。此外,我们确定MSK1是p65的核激酶,因为MSK1以刺激依赖的方式与p65结合,并在Ser276磷酸化p65。这种效应与组蛋白H3等核小体成分的磷酸化一起,是导致NF-kappaB依赖性基因表达选择性转录激活的重要步骤。

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数字

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图1。NF-κB依赖性基因表达的调节。(A类)L929sA细胞未经处理或用2000 IU/ml TNF处理,或与10µM H89联合处理,或在用10µM SB203559和10µMU0126预处理2 h后处理,分离mRNA并进行northern blot分析。(B类)在用2000 IU/ml TNF处理6小时后,测试各种细胞系中IL-6的产生,这些TNF是用10µM SB203580和10µM U0126预处理或不预处理的。(C类)用E-选择素、IL-8或IL-6启动子和pPGKβgeobpA的报告质粒稳定转染L929sA细胞。转染者未经治疗或使用2000 IU/ml TNF治疗6小时,或者与10µM H89联合使用,或者在使用10µM SB203580和10µL PD98059、20µM LY294002或100 nM沃特曼预处理2小时后使用。诱导因子定义为与非诱导状态相比,经TNF处理的细胞在β-半乳糖苷酶表达正常化后产生的荧光素酶量。(D类)对L929sA细胞进行了类似的实验,这些细胞稳定转染了合成的CREB-、AP1-或NF-κB依赖的报告基因结构。
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图2。激酶抑制剂对TNF诱导的NF-κB结合、p65磷酸化和反式激活的影响。(A类)L929sA细胞未经处理或用2000 IU/ml TNF处理30分钟,与10µM H89联合使用和/或用10µM SB203580和/或10µL PD98059预处理2小时。总细胞裂解物与32P标记的IL-6κB位点探针。通过EMSA分析所形成的配合物。通过与阻遏分子RBP-Jκ(Plaisance.,1997年)。(B类)用p(Gal4)瞬时转染稳定表达Gal4 DNA结合域、Gal4-VP16、Gal4-p65或其丝氨酸突变变体的L929sA细胞池2hu.IL6-luc+。转染后48小时,细胞未经处理或用2000 IU/ml TNF处理6小时。稳定表达Gal4-p65的池也用10µM H89共同处理,或用10μM SB203580和10μM PD98059预处理2 h。(C类)[32P] 在TNF前2 h,在没有或存在10µM H89的情况下,用5000 IU/ml TNF刺激正磷酸盐标记的L929sA细胞15分钟。用抗p65抗体免疫沉淀总细胞裂解物,用10%SDS-PAGE分析,并用磷成像技术进行可视化。(D类)L929sA小鼠成纤维细胞在0.5%血清中饥饿24小时。静态细胞单独用2500 IU/ml TNF处理20分钟,或在用10µM H89预处理2小时后处理。顶板,DAPI染色核;底部面板,用抗磷酸化Ser276 p65抗体获得的相应信号。
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图3。Ser276是TNF介导的p65反式激活的关键残基。用表达质粒组合瞬时转染HEK293细胞,即180 ng p1168hu。IL6-luc+、20 ng pPGKβgeobpA、2 ng pRcRSVp65(或相应的突变版本)和100 ng p300表达质粒(pCIp300或pCIp400ΔHAT)。通过补充空载体DNA,DNA总量在所有设置中保持不变。转染后42小时,细胞被裂解。测定荧光素酶水平,并通过归一化β-半乳糖苷酶水平校正转染效率。此外,用越来越多的pRcRSVp65或pRcRSAVp65 S576C转染HEK293细胞(每培养皿总剂量为12µg,转染30–900 ng)。通过western blot分析测定细胞质(c)和核(n)蛋白提取物的p65表达。
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图4。MSK1被TNF激活体内磷酸化p65的Ser276在体外. (A类)L929sA细胞在无血清培养基中饥饿48小时,并用2000 IU/ml TNF刺激。细胞被裂解,内源性MSK1被免疫沉淀分离。MSK1的活性由在体外激酶分析。(B类)在血清饥饿2天后,将L929sA细胞在补充有10µM SB203580、10µM PD98059或组合的无血清培养基中培养4 h。在存在或不存在这些抑制剂的情况下,用2000 IU/ml TNF处理细胞15分钟。细胞裂解后,对MSK1进行免疫沉淀,并检测其磷酸化CREBtide的能力。如有说明,H89包含在在体外反应。(C类)用2000 IU/ml TNF处理L929sA细胞。蛋白质印迹显示核提取物中存在p65。(D类)MSK1是从HEK293细胞中分离出来的,该细胞过度表达wt MSK1或激酶缺失突变体,以及上游激活物p38和MKK6。免疫沉淀物用于在体外与任一wt GSTp65的激酶反应12–317或相应的Ser276突变体(S276C)在30°C下保存20分钟,然后进行SDS–PAGE。用15 ng纯化的PKAc进行了类似的实验。
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图5。MSK1磷酸化物p65体内. (A类)用相关表达载体瞬时转染HEK293细胞,并用[32P] 正磷酸盐处理4h。细胞裂解物用抗p65抗体进行免疫沉淀。沉淀蛋白通过SDS-PAGE分离,并使用磷成像技术进行分析。(B类)与(A)中的实验类似,但使用抗Flag抗体进行免疫沉淀。
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图6。p65与激活的MSK1相互作用体内. (A类)使用p65、标记的wt MSK1或C末端激酶缺失MSK1(MSK1-CKD)的表达载体瞬时转染HEK293细胞。通过共同转染MKK6和p38激酶实现MSK1的激活。转染后48小时,通过免疫沉淀分离Flag-MSK1。使用抗p65抗体(a)通过免疫印迹检测共沉淀p65。为了监测MSK1的激活状态,使用抗标记抗体(b)剥离并重新制备印迹。(B类)用10µM H89预处理L929sA细胞2 h,然后用2000 IU/ml TNF诱导或不诱导15 min。制备细胞质和核细胞裂解物,并用MSK1抗体进行免疫沉淀。用抗p65抗体进行western分析检测到共沉淀p65。
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图7。TNF治疗后,MSK1及其磷酸化底物定位于内源性IL-6启动子。L929sA小鼠成纤维细胞在0.5%血清中饥饿24–48小时。静态细胞仅用2500 IU/ml TNF处理30分钟,或在用抑制剂SB203580+PD98059(10µM)或H89(10μM)预处理2小时后处理。对MSK1或磷酸化NF-κB p65(Ser276)进行ChIP分析(A类C类)或磷酸化H3(Ser10)(C)。在交联逆转后,用IL-6或H4启动子特异性引物集对共免疫沉淀基因组DNA片段进行27个周期的定量PCR分析。输入反映免疫沉淀前出现的声波DNA片段的相对数量,并通过使用IL-6或H4特异性引物的定量PCR显示。(B)(A)中获得结果的示意图。
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图8。MSK1的特性–/–/MSK2型–/–MEF公司。MSK1系列–/–/2号MSK2–/–用2000 IU/ml TNF处理wt细胞达到指定时间。制备细胞核和总细胞提取物,以分别观察p65和IκBα降解的核导入(A类)和NF-κB DNA结合能力(B类). (C类)将Gal4-p65表达载体与p(Gal4)瞬时转染MSK1/MSK2双敲除和wt MEFs2hu.IL6-luc+。转染后48小时,细胞未经处理或用2000 IU/ml TNF处理6小时。对相应的细胞裂解物进行荧光素酶活性分析,并通过定量pPGKβgeobpA共转染时表达的β-半乳糖苷酶水平,对转染效率进行标准化。(D类)TNF诱导的wt或MSK1的共焦显微镜图像–/–/2号MSK2–/–MEF显示Ser276磷酸化p65(绿色)和PI染色(红色)细胞核。(E类)L929sA,重量和MSK1–/–/2号MSK2–/–MEF未经处理或使用2000 IU/ml TNF处理4 h,无论是否使用10µM SB203580和10µM U0126预处理2 h。根据制造商的说明,使用GEArray技术分离并分析总RNA。特定mRNA表达因负荷差异而标准化。
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图9。导致IL-6增强体激活的磷酸化途径概述。Ac,乙酰基;活化蛋白-1;BTM,基础转录机制;C/EBP、CCAAT增强子结合蛋白;CREB,cAMP反应元件结合蛋白;p/CAF,p300/CBP相关因子;Pol,聚合酶;SRC,类固醇受体激活剂。

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