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.2002年12月；22(24):8659-68.
doi:10.1128/MCB.22.24.8659-8668.2002。

p63亚型的复杂转录效应：新的激活和抑制结构域的鉴定

帕梅拉·吉奥尼 1, 法布里奇奥·博洛涅斯, 帕斯卡·H·G·杜伊夫, 汉斯·范博霍文, 罗伯托·曼托瓦尼, 路易莎游击队
附属公司

p63亚型的复杂转录效应：新激活和抑制域的鉴定

帕梅拉·吉奥尼等。 分子细胞生物学. 2002年12月.

摘要

p63是一种与p53抑癌基因结构相关的转录因子。C-末端区域与p53的不同之处在于，它包含一个无菌的α基序（SAM）域，并且受到多种选择性切割的影响。N末端区域存在于转录激活（TA）和DeltaN构型中，后者缺乏转录激活域1。p63的单氨基酸取代和移码突变导致人类上睑外胚层发育不良-解理（AEC）或手指缺失-外胚层发育不良和面部解理（EEC）综合征。我们系统地比较了野生型p63亚型和自然突变体在p53调控的三个启动子的激活和抑制分析中的活性。我们发现，具有改变的SAM域或无SAM域的p63蛋白-β亚型、EEC移码突变和错义AEC突变-都显示出MDM2启动子的激活水平明显较高，并降低了对HSP70启动子的抑制。SAM与GAL4 DNA结合结构域的融合抑制了异源启动子。通过比较天然启动子和GAL4融合系统中DeltaN亚型的激活情况，发现了第二个激活域TA2，对应于外显子11至12。在菌落形成分析中，与p63alpha对应物相比，AEC突变体（而非EEC移码）在TA版本和DeltaN版本中抑制生长的效率始终较低。这些数据突出了p63的模块性，将SAM域确定为主要的转录抑制模块，并表明AEC和EEC移码突变体的特点是破坏了p63转录潜能。

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图1。
图1。
p63结构的示意图。图中显示了p53和p63基因的内含子-外显子结构，显示了p63转录起始位点和产生α、β和γ亚型的3′端选择性剪接。指出了β和γ亚型中发生的外显子14和15内阅读框的变化。指出了EEC和AEC SAM域突变的位置。所有突变都位于外显子13内，预计只影响α亚型。
图2。
图2。
p63亚型的反激活潜力。（A） 转染的蛋白质被正确表达。用0.5μg所示质粒瞬时转染Saos-2细胞，转染36小时后在100μl裂解缓冲液中裂解。用抗myc抗体对不同体积的总细胞提取物进行免疫印迹：p53（10μl）（车道1）、TAp63α（10μl）（车道2）、ΔNp63α。（B） 用p21/WAFCAT报告质粒（0.5μg）转染Saos-2细胞（开放栏）。共转染不同数量的p53和p63亚型表达质粒（分别为5、25、100和300 ng；点状、黑色、虚线和灰色条）。36小时后，收集细胞并测定CAT活性。（C） 用pBP100报告质粒（0.5μg）（开条）和表达质粒转染Saos-2细胞，如图B所示。记者的基本活动设置为1。数据显示为相对于没有效应器的样品的折叠激活或抑制。每个直方图条表示三个独立转染重复的平均值。显示了标准偏差。
图3。
图3。
p63转染可诱导内源性MDM2 mRNA表达。显示了用所示质粒瞬时转染的Saos-2细胞提取的总RNA的Northern分析。MDM2 RNA在模拟转染细胞中几乎检测不到（1区）。正如预期的那样，p53转染诱导MDM2 RNA表达（通道2）；在TAβ转染子中观察到更强的诱导（泳道5）；TAγ亚型的转染能够很好地诱导MDM2 RNA（第7区）。转染TAp63α、ΔNp63α和ΔNp 63β亚型不会诱导MDM2 RNA表达（第3、4和6条通道）。将相同的过滤器与大鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）cDNA探针杂交，用于RNA负载的标准化。
图4。
图4。
Gal4-p63外显子的转录激活和抑制。（A） 用0.5μg所示质粒瞬时转染Saos-2细胞，转染36小时后在100μl裂解缓冲液中裂解。用抗GAL4抗体对10微升总细胞提取物进行免疫印迹。（B） G5XΔN报告子（0.5μg）（开条）与指示的GAL4载体（黑色和虚线条，分别为0.3和0.5μg，共转染到Saos-2细胞中。（C） PB11报告子（0.5μg）（开条）与指示的GAL4载体（黑色和虚线条；分别为0.3和0.5μg，共转染到Saos-2细胞中。数据显示为相对于没有效应器的样品的折叠激活或抑制。每个直方图条表示三个独立转染重复的平均值。显示了标准偏差。
图5：。
图5：。
EEC和AEC突变的转录调控。（A） 用p21/WAFCAT报告质粒（0.5μg）转染Saos-2细胞（开放栏）。共转染不同数量的p63亚型表达质粒（分别为5、25、100和300 ng；点状、黑色、虚线和灰色条）。36小时后，收集细胞并测定CAT活性。（B） 用pBp100报告质粒（0.5μg）（开条）转染Saos-2细胞，并与A组共转染。用0.5μg所示质粒瞬时转染（D和E）Saos-2细胞，并在转染36 h后在100μl裂解缓冲液中裂解。用抗myc（D）和抗GAL4（E）抗体对20微升总细胞提取物进行免疫印迹。（F） 将G5-PB11报告子（0.5μg，开条）与指示的GAL4载体（黑色和虚线条，分别为0.3和0.5μg）共同转染到Saos-2细胞中。数据显示为相对于没有效应器的样品的折叠激活或抑制。每个直方图条代表三个独立转染重复的平均值。显示了标准偏差。
图5：。
图5：。
EEC和AEC突变的转录调控。（A） 用p21/WAFCAT报告质粒（0.5μg）转染Saos-2细胞（开放栏）。共转染不同数量的p63亚型表达质粒（分别为5、25、100和300 ng；点状、黑色、虚线和灰色条）。36小时后，收集细胞并测定CAT活性。（B） 用pBp100报告质粒（0.5μg）（开条）转染Saos-2细胞，并与A组共转染。用0.5μg所示质粒瞬时转染（D和E）Saos-2细胞，并在转染36 h后在100μl裂解缓冲液中裂解。用抗myc（D）和抗GAL4（E）抗体对20微升总细胞提取物进行免疫印迹。（F） 将G5-PB11报告子（0.5μg，开条）与指示的GAL4载体（黑色和虚线条，分别为0.3和0.5μg）共同转染到Saos-2细胞中。数据显示为相对于没有效应器的样品的折叠激活或抑制。每个柱状图条代表三个独立转染重复品的平均值。显示了标准偏差。
图6。
图6。
通过表达wt和突变的p63亚型抑制生长。（A） 将p53、p63亚型和pcDNA表达载体（各0.3μg）转染到Saos-2细胞中。选择2周后，菌落固定并染色，以证明菌落形成受到抑制。（B） 该图表示与pcDNA转染板上检测到的相比，使用所示质粒获得的菌落数，设置为1。实验重复三次，共两次。显示了标准偏差。
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