IEX-1: a new ERK substrate involved in both ERK survival activity and ERK activation

doi:10.1093/emboj/cdf488

.2002年10月1日；21(19):5151-63.

doi:10.1093/emboj/cdf488。

IEX-1：一种参与ERK生存活性和ERK激活的新ERK底物

约瑟菲娜·加西亚¹, 叶云斌, 瓦莱里·阿伦兹, 克莱尔·勒图内克斯, 纪尧姆·佩泽伦, 弗朗索瓦斯·波尔图

附属公司

PMID： 12356731
预防性维修识别码：项目经理129026
内政部： 10.1093/emboj/cdf488

IEX-1：一种参与ERK生存活性和ERK激活的新ERK底物

Josefina Garcia（约瑟芬娜·加西亚）等。欧洲工商管理硕士J. 2002.

.2002年10月1日；21（19）：5151-63。

doi:10.1093/emboj/cdf488。

作者

约瑟菲娜·加西亚¹, 叶云斌, 瓦莱里·阿伦兹, 克莱尔·勒图内克斯, 纪尧姆·佩泽伦, 弗朗索瓦斯·波尔图

附属

¹法国巴黎圣雅克Fg街27号勒内笛卡尔大学科钦研究所血液科，INSERM U567，CNRS UMR 8104。

PMID： 12356731
预防性维修识别码：项目经理129026
内政部： 10.1093/emboj/cdf488

摘要

IEX-1是一种早期反应和NF-kappaB靶基因，与细胞活力的调节有关。我们在此表明，IEX-1是ERK的底物，并且IEX-1和ERK相互调节彼此的活动。IEX-1通过用活性ERK2磷酸化筛选分离，随后发现在ERK激活后在体内磷酸化。IEX-1与磷酸化ERK相互作用，但不与c-jun N末端激酶（JNK）或p38相互作用。通过ERK的磷酸化，IEX-1获得了抑制各种刺激诱导的细胞死亡的能力。反过来，IEX-1增强ERK激活以响应各种生长因子。通过使用ERK磷酸受体和/或ERK对接位点发生突变的各种IEX-1突变体，我们表明IEX-1的促生存作用取决于其磷酸化状态，而不是其增强ERK激活的能力。相反，IEX-1诱导的ERK激活调节需要ERK-IEX-1关联，但与IEX-1磷酸化无关。因此，IEX-1是一种新型ERK底物，在ERK信号传导中具有双重作用，既作为ERK下游效应器介导生存，又作为ERK激活的调节器。

PubMed免责声明

数字

**图1。**ERKs磷酸化IEX-1在体外. (A类)将一微克纯化GST或GST–IEX-1融合蛋白野生型（Wt）和突变体（T18A；T123AS126A；T/SA3；ΔBD）与纯化重组活性ERK2反应[³²P] ATP。用所示抗体通过放射自显影或免疫印迹（WB）对产物进行分析。(B类)IEX-1 Wt和ERK磷酸化和/或结合位点突变体的示意图。阴影区表示假定的IEX-1跨膜结构域。

**图2。**IEX-1在UT7细胞中的表达、磷酸化和亚细胞定位。(A类和B类)如图所示，稳定表达HA标记的IEX-1（A）或对照（B）的UT7细胞被剥夺细胞因子，并在没有或存在20µM PD98059的情况下用TPO刺激不同时间。通过总细胞裂解物的免疫印迹法监测ERK激活以及磷酸化和非磷酸化形式的IEX-1的存在。(C类和D类)用TPO刺激表达空载体（C）或HA-tagged Wt-IEX-1或T/SA3-IEX-1（D）的UT7细胞3小时，裂解并进行差速离心。装载来自每个细胞部分的蛋白质（100µg）：重膜（HM）、轻膜（LM）、细胞质（C）和细胞核（N）。细胞色素特异性抗体*c（c）*用（cyt c，线粒体标记）、caspase-3（细胞溶质标记）和PARP（核标记）对组分进行表征。

**图3。**IEX-1与ERK1/2的活性形式特异结合。(A类和B类)如图所示，用未经处理（0）或用10 nM TPO或100 ng/ml茴香霉素（Aniso）刺激的UT7细胞裂解液培养Sepharose-bound GST或GST-IEX-1野生型和突变体30分钟。利用针对ERK、JNK或p38活性形式的抗体进行免疫印迹，在GST沉淀物或总裂解物（TL）样品中检测到MAPK。(C类和D类)用2µg pcDNA-HA-IEX-1（Wt或ΔBD突变）或空载体（V）转染Cos7细胞，饥饿过夜，用100 ng/ml EGF刺激（+）或不刺激（-）10分钟。用抗HA或抗ERK1抗体对裂解液进行免疫沉淀（IP），并用western blotting进行分析。ERK和HA-IEX-1的表达以总裂解物（TL）表示。(E类)UT7细胞（50×10⁷)用TPO处理3 h以诱导内源性IEX-1蛋白表达。如图所示，在抗IEX-1、抗磷酸ERK或对照（C）免疫沉淀物（IP）中监测IEX-1和磷酸化ERK的存在。作为对照，磷酸化ERK和IEX-1的表达在1×10的总裂解物（TL）中显示⁶细胞。

**图4。**IEX-1增强ERK活性。(A类)如图所示，CHO细胞与1微克pcDNA-HA-ERK1和1微克空载体（V）或编码His-Wt-IEX的质粒联合转染。20小时后，通过western blotting或以MBP为底物的激酶分析测定抗HA免疫沉淀物（IP）中ERK的活性。(B类)用TPO刺激表达不同水平HA-IEX-1的UT7细胞或对照细胞（Neo）的稳定克隆30分钟，并用抗磷酸ERK抗体进行western blotting检测ERK激活。

**图5。**IEX-1对生长因子介导的ERK激活动力学和剂量反应的影响。用HA-ERK和空pcDNA（V）或pcDNA-HA-IEX-1转染CHO-ER细胞。转染后20小时，直接收集细胞（无靶）或在用1–10 U/ml EPO刺激前隔夜饥饿血清10分钟(A类)，或不同时间4 U/ml EPO(B类). 分析抗-HA-免疫沉淀物中HA-标记ERK的活性。

**图6。**IEX-1的表达参与了TPO在UT7细胞中诱导的长期ERK激活。如图所示，用编码HA-ERK1（上面板）或HA-IEX-1（下面板）的质粒以及IEX-1或GFP siRNA双工体电穿孔UT7细胞。在不同时间的TPO刺激后，评估抗-HA-免疫沉淀剂中HA-ERK的活性。

**图7。**IEX-1刺激ERK活性的能力是特异性的，需要其DEF基序。(A类)用HA-IEX-1和HA-JNK1或空载体（V）转染CHO细胞，并用100 ng/ml茴香霉素处理或不处理10 min。通过用抗磷酸JNK抗体的免疫印迹和通过*在体外*以GST–c-jun为底物的激酶分析。(B类和C类)用HA-ERK和空载体（V）、编码指定HA-IEX-1物种或HA-Elk1的质粒转染CHO细胞。通过以下方法测定抗HA免疫沉淀物中ERK的活性*在体外*激酶分析。

**图8。**IEX-1抑制各种刺激诱导的细胞死亡。(A类和B类)用空（Neo）或HA-IEX-1（Wt）编码质粒稳定转染的UT7细胞克隆与EPO培养。通过去除培养基中的EPO诱导细胞凋亡，并通过annexin V–FITC染色（A）或抗caspase-3抗体免疫印迹（B）进行检测。抗-HA免疫印迹显示转基因在不同克隆中的表达（下部面板）。(C类)CHO或(D类)用pEGFP或pEGFP-IEX-1瞬时转染HeLa细胞。转染后20小时，用STS（C）或TNF+CHX（D）处理细胞，如图所示。EGFP阳性转染细胞的凋亡按照材料和方法中的描述进行测定。（D）三个独立转染的平均值±SE。

**图9。**IEX-1磷酸化是其生存效应所必需的。(A类)稳定表达HA标记的Wt-IEX-1、T/SA3-IEX-1和ΔBD-IEX-1或空载体（Neo）的UT7克隆被去除细胞因子，并在指定时间用膜联蛋白V-FITC染色。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。(B类)用EGFP或EGFP-IEX-1野生型或突变型融合蛋白瞬时转染CHO细胞。STS处理7 h后诱导细胞凋亡，并按照材料和方法中的描述在EGFP转染细胞中进行测量。结果是至少四次独立转染的平均值±SE。(C类)用抗磷酸化IEX-1和抗GFP抗体进行western blotting分析转染CHO细胞并按（B）处理的总裂解物。

**图10。**IEX-1抑制凋亡独立于其增强ERK激活的能力。(A类,B类和E类)用编码EGFP标记的野生型或突变型IEX-1的指示质粒转染CHO细胞。在存在或不存在30µM PD98059的情况下，用STS处理7小时后，对细胞进行裂解以进行蛋白质印迹分析（a）或固定以测定细胞死亡（B和E）。凋亡结果表示为四个独立实验的平均值±SE。(C类和D类)用HA-IEX-1野生型或突变体转染CHO细胞，转染（C）或不转染（D）HA-ERK1。如图所示，HA免疫沉淀物进行激酶分析和western印迹。

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[1] Arlt A.，Grobe，O.，Sieke，A.，Kruse，M.L.，Folsch，U.R.，Schmidt，W.E.和Schafer，H.（2001）NF-κB靶基因IEX-1（p22/PRG1）的表达不会阻止细胞死亡，而是触发HeLa细胞的凋亡。癌基因，20，69–76。-公共医学

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[9] Breitschopf K.，Haendeler，J.，Malchow，P.，Zeiher，A.M.和Dimmeler，S.（2000）Bcl-2的翻译后修饰促进其蛋白酶体依赖性降解：相关信号通路的分子特征。摩尔细胞。《生物学》，1886-1896年20月。-项目管理咨询公司-公共医学

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