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.2002年5月;22(10):3358-72.
doi:10.1128/MCB.22.10.3358-3372.2002。

ERAP140,一种保守的组织特异性核受体辅活化因子

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ERAP140,一种保守的组织特异性核受体辅活化因子

邵文林等。 分子细胞生物学. 2002年5月.

摘要

我们报告了一种新型核受体辅激活剂ERAP140的鉴定和表征。使用ERα-配体结合域作为探针,在ERα-相互作用蛋白的筛选中分离ERAP140。ERAP140蛋白没有序列,与其他核受体辅因子几乎没有结构同源性。然而,已在小鼠、果蝇和秀丽隐杆线虫中鉴定出ERAP140的同源物。ERAP140的表达是细胞和组织类型特异性的,在大脑中最丰富,其表达仅限于神经元。除了与ERα相互作用外,ERAP140还结合ERβ、TRβ、PPARγ和RARα。ERAP140通过非经典相互作用基序与ERα相互作用。ERα-ERAP140关联可以被辅激活子NR盒竞争,表明ERAP140在类似于其他辅激活子的表面上结合ERα。ERAP140可以增强与其相互作用的核受体的转录活性。在体内,ERAP140被雌激素结合的ERα招募到内源性ERα靶基因的启动子区域。此外,E(2)诱导ERAP140向启动子的募集遵循与其他辅激活子类似的循环模式。我们的结果表明,ERAP140代表了一类独特的核受体辅激活子,它介导特定靶组织中的受体信号。

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图1。
图1。
一种新的雌激素受体相关蛋白ERAP140的鉴定。(A) ERAP140的氨基酸序列。全长ERAP140 cDNA编码942个氨基酸的蛋白质,质量约为140kDa。位于N末端的二分核定位信号用方框表示。两个插入序列(带下划线)可能代表剪接变体。(B) ERAP140蛋白质结构示意图。标记富含碱性、酸性或半胱氨酸和组氨酸残基的区域,并指示两个剪接变体的位置(Δ)。NLS,核定位信号。(C) ERAP140基因组DNA由15个外显子组成,全长150 kb;其编码区域由实心方框表示,非编码区域由点画方框表示。星号表示拼接变体的位置。(D) ERAP140与从人类到酵母等不同物种中鉴定的蛋白质具有序列同源性。显示了ERAP140中三个最保守的结构域,并且在同源结构域上方显示了每个蛋白质相对于ERAP140的同一性百分比。
图2。
图2。
在体内雌二醇存在下,ERAP140与ERαLBD相互作用,这种相互作用需要ERαLBD/AF-2结构域。(A) 从MCF-7细胞制备全细胞提取物,并在不存在(−)或存在(+)1μM E的情况下与GST-ER LBD孵育2洗脱结合蛋白,在SDS-PAGE上电泳,转移到硝酸纤维素膜上,用针对ERAP140λ7区域(氨基酸181-637)的多克隆抗体进行Western分析。仅GST作为阴性对照,凝胶中含有25μg MCF-7全细胞提取物作为阳性对照。(B) GST-λ7融合蛋白与[35S] 在缺乏(−)或存在1μM E的情况下,在体外翻译的ERα或ERαΔAF-2中标记蛋氨酸2。结合反应中使用的20%的受体显示为输入。结合蛋白被洗脱,在SDS-PAGE上解析,并通过放射自显影术显示。
图3。
图3。
ERAP140 mRNA和蛋白在各种肿瘤细胞系和人体组织中均有不同水平的表达。(A) ERAP140 mRNA水平在不同肿瘤细胞系之间存在差异。在收获之前,将细胞在无雌激素的条件下培养3天。从每种细胞类型制备总RNA,并通过Northern印迹进行分析;18S作为加载对照。(B) ERAP140 mRNA水平不受雌二醇调节。细胞在无雌激素条件下培养3天,然后用(+)或不用(−)1μM E处理2然后收集总RNA并通过Northern印迹分析。(C) ERAP140 mRNA在大多数被检测的人体组织中表达水平较低,但大脑除外,大脑中ERAP140表达水平较高。对含有1μg poly(a)的印迹进行Northern分析+来自12种不同人体组织的每道RNA(Clonetech)。(D) ERAP140蛋白在多种肿瘤细胞系中以不同水平表达。在SDS-PAGE上解析每个细胞系的20微克核提取物,并使用λ7片段的多克隆抗体进行Western印迹分析。
图4。
图4。
通过原位杂交,ERAP140在小鼠肾皮质和大脑神经元中特异性表达。放大面板B、E、H和K中方框内指示的区域,以便更好地显示面板C、F、I和L。使用DIG标记的反义RNA检测成年小鼠大脑矢状截面中的ERAP140 mRNA;ERAP140 mRNA的神经元特异性定位在小脑(B和C)、海马(E和F)和大脑皮层(H和I)。在小脑中,ERAP140 mRNA在所有三层中都被发现,包括分子层、浦肯野细胞层和颗粒层。ERAP140 mRNA在海马中定位于锥体细胞层,在大脑皮层中定位于所有神经元细胞。在肾脏中,ERAP140 mRNA在皮质中发现,但在髓质中未发现(K和L)。使用Sense RNA作为阴性对照(a、D、G和J)。棒材:A和B,500μm;C、 50微米;D、 E、G和H,300μm;F和I,30μm;J和K,120μm;五十、 12微米。
图5:。
图5:。
ERAP140在体外与特定的核受体亚群相互作用。GST-λ7融合蛋白与[35S] 在缺乏(−)或存在1μM浓度的各自配体的情况下,在体外翻译受体中标记蛋氨酸。仅GST被列为阴性对照。
图6。
图6。
ERα相互作用域映射到ERAP140中氨基酸489和559之间的中心区域,其中L523和I524残基对ERα结合至关重要。(A) 示意图中显示了λ7和ERAP140的不同片段。将片段融合到GST并与35不存在(−)或存在1μM E时的S标记ERα2或ER拮抗剂他莫昔芬(T)。结合反应中使用的ERα的10%作为输入。(B) 将片段ERAP 489-559中的特定亮氨酸和异亮氨酸残基突变为丙氨酸(粗体),并检测突变体在缺乏(−)或存在1μM E的情况下的ERα结合能力2计算机分析预测ERAP 489-559中带下划线的序列为α螺旋结构。
图7。
图7。
ERAP140通过类似于p160辅活化子mGRIP1的结合表面与ERα相互作用。(A)35在没有(−)或存在(+)1μM E的情况下,用GST-ER LBD培养S-标记的体外翻译mGRIP12将纯化的野生型ERAP 489-559片段或489-559Mut B的浓度增加(1、10和100 nM和1μM)添加到反应中。(B) GST-ER LBD与35在没有(−)或存在(+)1μM E的情况下检查S-ERAP1402随着肽添加量的增加。肽序列显示在底部;NR框为粗体并带下划线。
图8。
图8。
ERAP140增强核受体的反式激活,并在与DNA连接时具有内在转录活性。(A) HepG2细胞在转染前在无激素条件下放置过夜。用核受体及其各自的报告基因共同转染细胞,100 ng pcDNA3.1-ERAP140要么包含(+)在转染中,要么不包含(-)。在转染后20小时,用载体(对照)或100 nM E处理细胞2,100毫微米31μM BRL或100 nM T-RA,如图所示,培养24小时后收获。通过荧光素酶分析测定转录活性。(B) 用100 ng的pCMX-βGal、100 ng的(GAL4 X 5)SV40-Luc报告子和400 ng的GAL4 DBD或增加浓度(100、200、400、800 ng和1μg)的GAL4-DBD-ERAP140融合基因共同转染Cos-1细胞。反式激活水平由相对荧光素酶活性表示。ERAP140的共激活水平与GAL4 DBD单独的共激活程度相比具有统计学意义(P(P)<0.05)从200-ng浓度开始,如星号所示。所有实验均使用重复样本进行了多次,显示的结果具有代表性。误差线表示标准偏差。
图9:。
图9:。
在体内,ERAP140被ERα招募到内源性ER靶基因pS2的启动子。(A和C)通过ChIP分析检测ERα、AIB1和ERAP140与pS2启动子的体内结合。仅载体pcDNA/T7-ERAP140(A)或两个T7-标记ERAP140突变体(C)中的任何一个突变体A或突变体B在MCF-7细胞中瞬时表达。用100 nM E处理的细胞制备可溶性染色质2持续45分钟(+)或未经治疗(−),并用抗ERα、AIB1和T7标签的抗体进行免疫沉淀。使用侧翼pS2启动子区ERE的引物扩增共沉淀DNA;引物相对于转录起始位点的5′端如图A所示。包括免疫沉淀前可溶性染色质中总pS2启动子DNA的存在作为输入。(B和D)T7标记的野生型或突变ERAP140蛋白在用相应质粒转染的MCF-7细胞中的表达。转染后2天制备全细胞提取物,并用抗T7抗体进行蛋白质印迹分析。
图10。
图10。
ERAP140以动态方式被招募到pS2启动子。用pcDNA/T7-ERAP140瞬时转染MCF-7细胞,转染2天后,用100 nM E处理细胞2适用于指定的时间。然后从细胞中制备可溶性染色质,然后使用抗ERα、抗T7或抗RNA Pol II抗体进行免疫沉淀。共沉淀DNA经PCR扩增。

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